|
临床生信之家目前有2种生信服务模式： 1.提供完整技术路线的设计和分析报告（包括原始数据，方法学，结果图及解读） 2.深度合作，协同完成从选题到发表的全过程，未达到协议目标，将全额退款！ 扫码咨询相关分析套路的研究方法 肿瘤微环境高度的异质性严重阻碍了免疫治疗的效果。近年来PD-1/PD-L1抑制剂疗法已被批准用于肿瘤治疗，但由于肿瘤微环境中免疫抑制的限制，仅有少部分肿瘤患者能够获得持久的临床反应。免疫微环境中免疫细胞的状态能够直观的反应患者免疫功能，免疫细胞的状态也会随着环境的差异而发生变化。单细胞测序技术的进步，让我们可以从单个细胞亚群的角度解读肿瘤和肿瘤免疫微环境的异质性。 今天的主角是乳腺癌，文章题目：Mapping the Tumor Microenvironment in TNBC and Deep Exploration for M1 Macrophages-Associated Prognostic Genes。文章实在今年6月份发表在Frontiers in Immunology。 研究背景 乳腺癌作为女性中最常见的癌症，已经成为20至59岁女性癌症死亡的主要原因。三阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌病例的10-15%，由于ER、PR和Her2表达不足，缺乏有效的治疗靶点。免疫疗法在TMBC上的推行由于免疫抑制肿瘤微环境（TME）的限制，在TNBC中仅有极少数患者获得较好的治疗效果。仍需要对肿瘤免疫微环境中特异性标志物进行挖掘，以分析肿瘤和TIME的异质性 材料和方法 1）数据源：单细胞和大量RNA测序多组学数据，包含FUSCC的总共360名TNBC患者，TCGA队列的158名TNBC患者，以及5名TNBC患者的scRNA-seq数据。 2）相关性和生存分析：进行Pearson系数分析以探索相关性，并应用“生存”包完成生存分析。 3）GSEA富集分析：GSEA软件基于分子特征数据库MSigDB下载三个经典的巨噬细胞相关基因集富集分析。 4）体外实验：细胞培养、qRT-PCR和Western blot、免疫荧光和免疫组化。 结果展示 ①TNBC的肿瘤内和肿瘤间异质性：scRNA-seq分析探索了TNBC的肿瘤内和肿瘤间异质性，成功注释了12个细胞簇，包括多个免疫细胞簇、上皮细胞、基质细胞、内皮细胞和组织干细胞。进一步探索上皮细胞分为总共11种恶性细胞亚型。为了更有效地证明肿瘤内部和肿瘤之间存在异质性，描绘出每个患者肿瘤中不同细胞亚群的组成比。病例之间的细胞亚群比例不同，表明存在肿瘤内和肿瘤间异质性。 使用inferCNV进一步探索了各种肿瘤细胞亚型的基因组拷贝数变化，肿瘤内部的异质性不仅体现在组成成分上，还体现在基因突变的形式上。
②肿瘤免疫微环境的复杂性和异质性：使用经典标记确定了八个免疫细胞簇研究TIME的复杂性和可变性。使用SingleR和规范标记的组合方法在不同的细胞簇中鉴定了标记基因。研究发现，经典的免疫抑制细胞由CD4+Treg细胞（FOXP3和CTLA4）和M2巨噬细胞（CD163和VSIG4）组成。为了有效探索TIME的异质性，进一步估计了每个患者中每个免疫细胞亚群的比例。免疫细胞的分化轨迹是由伪时间构建的，伪时间是衡量单个细胞在细胞分化过程中取得多少进展的指标。基于这一分化轨迹，说明髓系免疫细胞和淋巴系免疫细胞是分开分化的，免疫细胞的分化轨迹是多变的。
③巨噬细胞在肿瘤免疫微环境中的意义：为弥补scRNA-seq分析的样本量局限性，补充CIBERSORT”包评估FUSCC和TCGA TNBC队列的大量RNA测序。结果显示巨噬细胞在所有22种免疫细胞中占非常高的比例。 不同免疫细胞浸润对患者预后的影响，通过“CIBERSORT”软件包估算免疫细胞浸润评分将患者分为高低浸润组进行两组之间的生存分析。分析两个队列的结果，显示较高的M1巨噬细胞浸润与更好的预后相关。
④高和低巨噬细胞浸润之间的突变景观：分析M1 高和低巨噬细胞浸润组之间的突变情况。比较两组前 20 个突变基因时，发现只有 9 个基因有共同突变，包括 TP53、PIK3CA、TTN、MUC16、KMT2C、OBSCN、PTEN、RYR2 和 DNAH9。
⑤与 M1 巨噬细胞浸润相关的关键标记基因：为了识别与 M1 或 M2 巨噬细胞浸润相关的关键标记基因，WGCNA 用于构建无标度网络。从 FUSCC 和 TCGA TNBC 队列中共鉴定出 54 和 52 个基因模块，其中FUSCC浅青色模块、TCGA中的浅黄色与较高的 M1 巨噬细胞浸润相关。从两个模块中取top30 hub基因的交集时，我们惊奇地发现有22个基因重合，包括IFIT3、IFI35、OAS2、PSMB9、SAMD9L等。
⑥与M1浸润相关的三个典型基因与更好的预后相关：比较了M1高和低巨噬细胞浸润组之间22个基因的表达差异，在来自FUSCC和TCGA数据集的M1高巨噬细胞浸润组中都有较高的表达。其中只有IFI35、PSMB9和SAMD9L的高表达与较好的预后相关。
⑦探索IFI35、PSMB9和SAMD9L和M1巨噬细胞之间的关系：计算三个基因与M1巨噬细胞浸润评分之间的相关性，显示所有基因与M1巨噬细胞浸润呈正相关。GSEA数据集中提取了三个经典的巨噬细胞激活、趋化性和迁移基因组分析与IFI35、PSMB9和SAMD9L表达之间的关系。高IFI35、PSMB9和SAMD9L表达与巨噬细胞活化，趋化性和迁移呈正相关。 进一步探讨IFI35、PSMB9和SAMD9L的高表达与模块相关性。大约50%的基因组富含这IFI35、PSMB9和SAMD9L的高表达。
⑧巨噬细胞的M1极化上调IFI35表达：为了确认生物信息学分析结果，选择IFI35进行进一步验证。基于scRNA-seq数据显示IFI35主要以髓源性细胞为主，包括中性粒细胞、M1和M2巨噬细胞。在人类转录组分析中，M1巨噬细胞显示出比M2巨噬细胞更高的IFI35表达。另外免疫荧光显示IFI35在M1巨噬细胞的细胞质和细胞核中表达，在细胞形态上表现出细胞伸长。组织学上，CD86高表达的M1巨噬细胞表现出IFI35表达，这直接反映了IFI35与M1亚型巨噬细胞之间的密切联系。
结论 本研究中基于单细胞测序技术重新梳理免疫微环境中重要组分--巨噬细胞相关的特征基因对于TNBC患者的预后作用。研究不仅揭示了TNBC肿瘤内和肿瘤间的异质性，更是阐明IFI35、PSMB9和SAMD9L与TNBC中M1巨噬细胞之间的联系。干湿结合的方式也更好验证了IFI35可作为潜在的治疗靶点，以重塑TNBC患者中巨噬细胞向M1亚型的极化的过程。
|
|
|
