中药组合物多糖的提取工艺及抗氧化活性研究

谭超杰¹ 王博^1,2 邹文奇¹ 任晶¹ 刘静颐¹ 李春阳¹ 白丽丹¹ 盛瑜¹

1. 北华大学药学院 2. 遵义医科大学珠海校区

摘要：目的 优化中药（北虫草-刺五加）抗疲劳组合物中多糖的提取工艺，并探讨其体外抗氧化活性.方法 通过单因素试验、正交试验法优化北虫草-刺五加多糖（Cordyceps militaris-Acanthopanax senticosus polysaccharide, CAP）的提取工艺；通过体外1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）清除率、总超氧阴离子自由基（total superoxide anion free radical, SAFR）清除率和羟基自由基（hydroxyl free radical）清除率比较CAP与北虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides, CMP）、刺五加多糖（Acanthopanax senticosus polysaccharide, ASPS）的抗氧化能力差异；利用H2O2诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12细胞）,构建体外氧化损伤模型，从而考察三者体外抗氧化作用差异.结果 提取温度90℃、提取时间3 h、料液比m（样品，g）∶V（水，mL）=1∶40、提取次数3次为CAP的最佳提取工艺，多糖得率可达27.61%;CAP对DPPH的清除率最高可达到63.02%,对SARF的清除率最高达到67.52%,对HFR的清除率最高达到68.38%,均高于CMP和ASPS;100μg/mL的CAP可显著提高H2O2损伤的PC12细胞的存活率，并且可以显著提高PC12细胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和过氧化氢酶（Catalase, CAT）活力，显著降低PC12细胞中丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量，作用均高于同等浓度的CMP和ASPS.结论 该提取方法稳定可靠，获得的组合物多糖CAP具有明显的体外抗氧化活性，且能够通过减弱H2O2产生的活性氧而保护PC12细胞免受损伤，作用效果优于组合物中的各味中药多糖.

疲劳是当今社会各类人群普遍存在的生理现象，WHO最新调查结果显示：全球约有35%以上的人处于疲劳状态^[1,2].当人们长期处于疲劳状态，机体内氧化还原平衡就会被破坏，使机体出现氧化应激反应，造成机体组织不可逆的损伤，从而导致身体免疫力下降、精神不振，严重影响工作效率和生活质量^[3,4].研究^[5]发现：通过补充外源性抗氧化活性成分，改善机体内氧化应激水平，是目前抗疲劳的有效途径之一.

北虫草-刺五加抗疲劳胶囊是本团队根据中医理论将北虫草、刺五加等药食两用中药材进行科学配伍、开发的一种有助于抗疲劳的复方保健食品.其中，北虫草(Cordyceps militarisL.Link)与珍稀中药冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是同属异种，两者的化学成分和药理作用相近，因此，其在食品、药品、保健品等领域逐渐代替冬虫夏草，并在2009年5月被国家卫生部批准为新食品原料^[6,7].有研究^[8]发现：北虫草主要成分北虫草多糖具有显著的抗疲劳活性.刺五加(Acanthopanax senticosus)在中国医药学的应用历史悠久，《本草纲目》中记载，刺五加具有“补中益气，久服轻身耐老”的作用^[9,10].现代药理学研究^[11]发现：刺五加的抗疲劳作用与其抗氧化活性具有相关性，刺五加多糖具有抗氧化活性.

研究^[12,13,14]发现，黑参多糖、魔芋多糖、灵芝多糖等多种植物多糖和菌类多糖均具有显著的抗氧化和抗疲劳活性.因此，为了更有效地提取北虫草-刺五加抗疲劳组合物中的多糖，提高北虫草-刺五加抗疲劳胶囊质量，明确其功效部位，本研究通过正交试验，对北虫草-刺五加组合物中多糖提取工艺进行优化，并研究CAP、CMP、ASPS对DPPH、SAFR和羟基自由基清除作用与差异，同时考察三者对PC12细胞氧化损伤的保护作用，以期为北虫草-刺五加抗疲劳组合物药效的物质基础研究提供理论和试验依据.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

以大米为培养基的北虫草(国药控股潍坊有限公司);刺五加提取物(本实验室自制，符合药典要求);PC12 细胞株(上海传秋生物科技有限公司);DMEM培养基(上海杰美基因医药科技有限公司);葡萄糖标准品(酷尔化学科技(北京)有限公司);抗坏血酸(成都钠钶锂生物科技有限公司);其他试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计(SHIMADZU有限公司，日本);恒温生化培养箱(杭州川一试验仪器有限公司);纯水机(青州市路得自动化设备有限公司);全自动计数仪(Life Technologies公司，美国);Galaxy 170 S细胞培养箱(艾本德中国有限公司);酶标仪(山东莱恩德智能科技有限公司).

1.3 试验条件

1.3.1 北虫草-刺五加多糖的提取

按1∶1比例称取干燥北虫草子实体和刺五加提取物共10 g, 加适量蒸馏水搅匀，热水浸提，除去滤渣，将滤液浓缩，按1∶3的比例加入95%的乙醇溶液沉淀24 h, 醇沉后的粗多糖应用Sevag法去蛋白，最后冷冻干燥制得CAP备用.

北虫草子实体多糖提取：取北虫草子实体10 g, 按上述工艺提取，获得CMP备用.刺五加提取物多糖提取：取刺五加提取物10 g, 按上述工艺提取，获得ASPS备用.

粗多糖得率=粗多糖质量/药材质量×100%.

1.3.2 单因素试验

将影响CAP多糖得率的主要4个因素进行单因素试验设计，A为提取温度，B为提取时间，C为料液比，D为提取次数.见表1.

1.3.3 正交试验

在单因素试验的基础上，进行L₉(3⁴)正交试验，设计见表2.

1.3.4 最佳条件验证试验

根据正交试验中所得到的优化条件展开了3次平行试验，并以此检验该方案的可行性.

1.3.5 多糖体外抗氧化活性研究

北虫草-刺五加粗多糖、北虫草粗多糖、刺五加粗多糖经除蛋白、透析后，获得精制的CAP、CMP、ASPS多糖，得率分别为27.61%、21.43%、4.42%.

DPPH清除率测定：精密称取一定量的各组多糖粉末，加蒸馏水使其溶解，配制成不同浓度的储备液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL),各取1.0 mL溶液于试管中，参照文献[15]的方法测定CAP、CMP、ASPS对DPPH的清除率，以抗坏血酸为阳性对照.

超氧阴离子清除率测定：精密称取一定量的各组多糖粉末，加蒸馏水使其溶解，配制成不同浓度的储备液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL),各取1.0 mL溶液于试管中，按参照文献[16,16]的方法测定各组多糖对超氧阴离子的清除率，以抗坏血酸为阳性对照，每个样品平行测定3次.

羟基自由基消除率测定：精密称取一定量的各组多糖粉末，加蒸馏水使溶解，配制成质量浓度为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL的储备液，各取1.0 mL溶液于试管中，参照文献[15,16,16]的方法测定各组多糖的羟基自由基的消除率，以抗坏血酸为阳性对照，每个样品平行测定3次.

1.3.6 多糖对H2O2损伤PC12 细胞存活率的影响

多糖样品处理：将CAP、CMP、ASPS用DMEM高糖培养基稀释成浓度为200 μg/mL的溶液，备用.

试验分组：空白对照组、正常对照组 (10%小牛血清培养液)、损伤组、损伤组+200 μg/mL CAP组、损伤组+200 μg/mL CMP组、损伤组+200 μg/mL ASPS组.

在96孔板中以5×10⁴个/孔的浓度接种PC12细胞，在CO₂培养箱培养过夜(37 ℃).损伤组和多糖样品+损伤组每孔加入300 μmol/L H₂O₂溶液100 μL,处理4 h进行造模，CAP、CMP、ASPS模型组各加100 μL的多糖溶液，正常对照组加入等体积的细胞培养液，轻摇混匀后放入孵箱中孵育48 h, 参照文献[17]的方法测定各组细胞活力.

1.3.7 PC12细胞中SOD、CAT、MDA 的测定

根据试验1.3.6细胞造模条件得到的结果选取细胞，经药物作用48 h后，收集细胞并将其超声破碎，在4 ℃条件下，3 000 r/min离心10 min, 收集上清，按照试剂盒说明书检测细胞内SOD、CAT活力和MDA含量.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1看出，提取液中多糖的得率随着温度的上升而提高，继续提高温度，多糖得率不再上升，可能是高温导致部分多糖水解失活，故选择90 ℃作为最佳提取参数；提取时间在3～4 h范围内，多糖得率呈上升趋势，随着提取时间的延长多糖得率不再提高，考虑到提取成本，故选择提取时间4 h作为最佳提取参数；当液料比m(样品，g)∶V(水，mL)从1∶10增加到1∶30时，北虫草-刺五加多糖的得率逐渐上升，在料液比m(样品，g)∶V(水，mL)1∶30时多糖得率达到最高，之后多糖得率不再随着料液比的增加而上升，考虑到提取成本，故选择料液比m(样品，g)∶V(水，mL)1∶30作为最佳提取参数；当提取次数为3次时，北虫草-刺五加组合物的多糖得率最高，故选择重复提取3次作为最佳提取参数.

图1 北虫草-刺五加多糖不同提取因素对得率的影响

2.2 正交试验结果

由表3可知，因素A(提取温度)中k₂>k₃>k₁,因素B(提取时间)中k₂>k₃>k₁,因素C(料液比)中k₃>k₂>k₁,因素D(提取次数)中k₂>k₃>k₁,但R值显示因素D>B>C>A,故各因素对北虫草-刺五加组合物的粗多糖得率的影响顺序为提取次数>提取时间>料液比>提取温度.因此，最终选用A₂B₂C₃D₂为最佳提取条件，即提取温度90 ℃,提取时间3 h, 料液比m(样品，g)∶V(水，mL)=1∶40,提取次数3次，结果为提取时间>提取温度>料液比.

2.3 北虫草-刺五加多糖提取最佳条件验证试验

在正交试验所最终确定组合物多糖的最佳水提取条件下进行3次验证试验，得到的多糖平均得率为27.61%,接近于验证试验中最高得率(28.28%),且重复性较好，进一步确定了提取CMP的最佳提取工艺为提取温度90 ℃,提取时间3 h, 料液比m(样品，g)∶V(水，mL)=1∶30,提取次数3次.

2.4 多糖抗氧化结果

2.4.1 DPPH清除率测定

从图3看出，CAP、CMP和ASPS对DPPH的清除效果随着浓度的增加而增加，其中CAP的效果最好，尽管低于抗坏血酸，但清除率最高可达到63.02%.

2.4.2 SAFR清除率测定

由图4看出，CAP、CMP和ASPS对SAFR的清除率随溶液浓度的升高而增大，其中CAP的效果最好，最高达到67.52%.

图2 CAP、CMP、ASPS和抗坏血酸的DPPH清除率 

图3 CAP、CMP、ASPS和抗坏血酸对SAFR清除率

图4 CAP、CMP、ASPS和抗坏血酸对羟基自由基清除率

2.4.3 羟基自由基清除率测定

由图5看出，CAP、CMP、ASPS对羟基自由基的清除率随溶液浓度的升高而增大，其中CAP对羟基自由基的清除率明显高于CMP和ASPS.

2.5 各组多糖体外细胞抗氧化结果

2.5.1 各组多糖对H2O2损伤PC12细胞活力的影响

由图5可见，与正常组细胞比较，H₂O₂作用后的PC12细胞活力显著降低(P<0.01),给药(多糖CAP、CMP、ASPS)后细胞的增殖活性均有提高，其中CAP的上升趋势最显著 (P<0.01),给药组细胞的增殖活性均有提高，其中CAP的上升趋势最显著 (P<0.01).

图5 各组多糖对H₂O₂损伤PC12 细胞活力的影响

2.5.2 各组多糖对PC12细胞SOD、CAT活力和MDA含量的影响

由图 6、图7可见：与空白组比较，模型组H₂O₂诱导氧化损伤PC12细胞中SOD活力、CAT活力显著降低，说明模型建立成功(P<0.01).经CAP处理后，该治疗组PC12细胞中SOD活力、CAT活力显著提高(P<0.01).

图6 各组多糖对氧化损伤的PC12细胞SOD 活力的影响

图7 各组多糖对氧化损伤的PC12细胞CAT 活力的影响

图8 各组多糖对氧化损伤的PC12细胞MDA 活力的影响

由图8可见：与空白组比较，模型组PC12细胞经H₂O₂诱导氧化损伤后MDA含量显著提高，说明模型建立成功(P<0.01).经CAP处理后，治疗组的PC12细胞中MDA含量显著降低(P<0.01).

3 讨 论

本研究应用正交试验和极差分析对北虫草-刺五加组合物中多糖的提取工艺进行优化，最终确定北虫草-刺五加组合物中多糖的最佳水提取工艺为提取时间3 h、提取温度90 ℃、料液比m(样品，g)∶V(水，mL)=1∶40,该条件下重复提取3次粗多糖得率可达27.61%.在此工艺下，得到了北虫草-刺五加组合物的粗多糖，经醇沉，除蛋白、色素等杂质，冷冻干燥后，最终精制得到CAP.

研究^[18,19]表明：当机体疲劳时会诱导氧化应激的产生，从而产生大量ROS,过多的ROS使线粒体内膜的通透性非特异地增大导致线粒体膜电位降低，破坏线粒体功能，进而使细胞的功能与完整性被破坏，造成机体氧化损伤.因此，考察提取物的体外抗氧化活性，可以初步筛选其是否具有抗疲劳的潜在功效.本试验考察了CAP、CMP、ASPS对DPPH自由基、SAFR和HFR的清除能力，结果显示：CAP对DPPH自由基、SAFR和HFR的清除有较显著效果，清除率分别达到63.02%、67.52%和68.38%,上述结果证明CAP具有较强的抗氧化活性.

基于体外抗氧化试验的结果，本试验开展了细胞水平的体外抗氧化试验，选用H₂O₂诱导PC12细胞构建体外氧化损伤模型^[19,20].研究^[21]发现：当人们长期处于疲劳状态，其神经系统疾病(如帕金森病、创伤性脑损伤、中风、脑出血以及神经肌肉疾病)的患病率会明显增高.因此，本试验选用具备神经干细胞和成熟神经细胞的双重特性的PC12细胞进行试验.H₂O₂作为重要的ROS成分之一，可造成细胞的氧化应激损伤，被广泛用于细胞氧化损伤的研究^[22].本试验结果表明：用200 μg/mL的CAP、CMP、ASPS作用于氧化损伤PC12细胞24 h后，与模型组比较，各组细胞的增殖均呈增高趋势，其中CAP的增值趋势最为明显.SOD和CAT的活性能够反映出机体对自由基的清除能力，MDA含量的高低能够直接反映出机体被氧化损伤的程度.本试验中，与模型组比较，经CAP、CMP、ASPS处理后的氧化损伤PC12细胞中SOD活力、CAT活力均呈现升高趋势，MDA含量显著下降，其中CAP的趋势最显著(P<0.01).结果表明：CAP可以通过提高SOD和CAT的活力、降低MDA的表达进而对H₂O₂诱导氧化损伤的PC12细胞起到保护作用.上述细胞试验结果证明，CAP具有抑制由H₂O₂诱导的PC12细胞氧化损伤，CAP是北虫草-刺五加组合物的抗疲劳主要活性部位，同时，提示其具有成为以抗氧化为机制的抗疲劳保健食品潜力.

综上所述，本研究以正交法优化建立了北虫草-刺五加组合物中多糖的提取工艺，并通过体外试验验证了CAP在一定剂量范围内具有抗氧化活性.基于以上试验，初步明确了北虫草-刺五加组合物中的抗疲劳活性部位为多糖，此结果为其质量标准的制定提供了依据，也为进一步研发浓缩、高效的复合物多糖类抗疲劳保健食品提供了理论和技术支持.

END