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A33是一种II型整合膜糖蛋白，存在于细胞外病毒粒子 (EV) 和感染细胞的表面。该蛋白与病毒蛋白 A36、A34 和 B5在EV膜上 形成复合物。A33对病毒进入和细胞间传播至关重要，其基因A33R的缺失会导致小斑块表型和病毒体内减毒，抗A33抗体可抑制病毒在细胞培养物中的传播。研究发现A33疫苗对VACV、ECTV有抵御作用，而CPXV则不受影响。 1. CPXV从A33 VACV诱导的免疫机制中逃逸使用基于A33的蛋白质或DNA疫苗后发现A33对预防VACV、ECTV和MXPV有作用。此外，A33的抗体对预防VACV的攻击具有重要作用。在研究中，我们评估了表达牛痘病毒蛋白A33 (A33 VACV)的病毒载体对几种正痘病毒的保护作用。我们发现A33疫苗接种保护小鼠免受VACV-WR和ECTV的感染，但未能保护小鼠免受CPXV侵袭。通过将A33 CPXV结构域和残基引入A33 VACV，我们发现A33 VACV的疫苗赖于A33 VACV中的单个保护性表位。 为了测量基于A33 VACV的疫苗对CPXV感染的效力，我们用A33 VACV接种BALB/c小鼠，并在14天后用致死剂量的CPXV攻击它们。A33 VACV 疫苗接种的小鼠无法免受CPXV的致命攻击（Fig 1A，B），所有小鼠都以相似的速度减轻体重并死亡。为查清A33 VACV未能预防CPXV的原因是否是A33的序列变异，我们生成了编码A33的CPXV直系同源物的重组Sindbis病毒。当我们测试A33 CPXV抵御VACV攻击的能力时，接种A33 CPXV的小鼠发病并且40%死于感染，而所有A33 VACV都存活并且病灶较少（Fig 1E，F）。这揭示A33 VACV中存在针对VACV和ECTV的保护性表位在A33 CPXV中被修饰，使得A33 CPXV的保护性降低。
Fig 1. A33 疫苗接种不能预防牛痘病毒。 2. A33 中的保护区域为了阐明A33无法预防CPXV的机制，我们寻找A33 VACV和A33 CPXV之间的A33差异。包括猴痘Zair (MPXV-ZAR)、鼠痘病毒Moscow (ECTV-Moscow) 和孟加拉天花主要病毒 (VARV-BGD74_sol）的附加序列，以详细说明这些序列变异在正痘的病理学和保护能力中的作用。比较VACV和CPXV的氨基酸(aa)序列揭示了VACV和CPXV之间存在差异的两个主要区域，我们分别称为CP-I和CP-II的aa S82-S89和L112-L118 (Fig 2A)。CP-I区域的aa变化是CPXV独有的。A33的aa序列对于VACV攻击毒株和VACV疫苗毒株是相同的。 为详细说明这两个区域在保护中的作用，我们更换A33 VACV主干A33 CP-I区域不影响 A33 VACV的固有保护能力，小鼠的恢复与A33 VACV疫苗接种相似（Fig 2B）。然而，用A33 CP-II区域替换A33 VACV主干导致失去对VACV-WR挑战的保护（Fig 2B）。经测试的构造均未提供针对CPXV挑战的保护（Fig 2C）。由于VACV的CP-II区域被相应的CPXV区域取代导致保护丧失表明CP-II具有保护性但该表位在CPXV的相应CP-II区域中没有保护性。
Fig 2. 将保护性表位定位于A33的CP II区。 3. 鉴定A33中用于保护的氨基酸与A33 VACV相比，A33 CPXV中的CP-II区域有以下氨基酸取代：L112F、Q117K 和 L118S（Fig 3.A）。 为了检查这些替换中的哪些消除了保护，我们生成了修饰的A33 VACV基因，该基因含有A33 VACV主干上的 L112F、Q117K和 L118S 替换。此外，我们还产生了双突变A33基因（Q117K-L118S）。这些修饰的A33 VACV基因被克隆到Sindbis表达系统中。发现含有L112F取代的9-mer肽（代表 CPXV 直系同源肽）将失去结合MHC分子的能力，这是引发 CD8+ T细胞毒性的先决条件。 跨越A33 VACV的aa Y104至L112的H-2Kd CTL 表位在Sindbis A33 VACV疫苗接种后和 VACV疫苗接种后均未发生显着的特异性裂解。我们预测含有L112F取代的肽会阻止CTL活性，但反应较弱。
Fig 3. Sindbis A33在CP II区域内表达和诱导具有彗星抑制活性的抗体。 然后，用各种A33衍生物接种疫苗后测试了针对A33的血清IgG抗体水平，所有A33衍生物均诱导特异性抗体（Fig 3C）。然而，在接种A33 CPXV或L118S替代疫苗后检测到较低的抗体滴度（与 A33 VACV/A33 VACV L112F相比，P = 0.02 和 P < 0.01）。由于先前已证明针对A33的保护性抗体可抑制培养物中的EV传播，因此我们分析了通过彗星抑制测定不同血清抑制EV传播的能力。A33 VACV以及L112F或Q117K突变体抑制彗星的形成。相反，来自A33CPXV或L118S疫苗接种小鼠的血清对彗星形成的抑制很差（Fig 3D）。 讨论已经证明CP-II的替代消除了A33提供的保护，因此主要保护性表位位于 CP-II 内。然而，基于A33 CPXV 疫苗接种对VACV的部分保护，我们不能排除CP-I区域对CP-II区域具有补偿功能的可能性。修饰主要保护性表位内的几个残基是否会阻止中和抗体与A33的结合，从而使CPXV逃避A33免疫仍有待证明。 天花病毒及其抗原对天花病毒和其他正痘病毒的免疫保护是基于交叉保护。显示了基于亚单位疫苗和单克隆抗体的治疗产品的开发时应该仔细评估物种之间的序列变异。 |
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