创伤性脑损伤的多组学研究进展(下)

翻译：张伟东   编辑：未亚平

蛋白质组生物标志物

 

蛋白质组学涉及对生物体翻译或修饰的蛋白质的研究。分析蛋白质组最好能识别和定量细胞中表达的每一种蛋白质，从而深入了解途径调节和治疗目标。在过去的几十年中，蛋白质组学方法在多组学研究中占主导地位，其中MS是最常用的分析技术。MS/MS蛋白质组学方法可大致分为自上而下和自下而上两种。自下而上的蛋白质组学涉及早期的片段或消化成独特的肽，依靠质量指纹谱分析或解离信息来识别初始蛋白质的片段。相反，自上而下的蛋白质组学涉及完整蛋白质的'软'MS，然后用'硬'MS来测量蛋白质的片段，允许检测翻译后修饰和以初级序列信息为代价，检测翻译后修饰和特定位点突变。在MS方法中，电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光电离（MALDI）是流行的'软'电离方法，具有最小碎片。除了色谱技术[高效液相色谱、超高效液相色谱和疏水作用液相色谱]，电泳方法[凝胶电泳、二维凝胶电泳和毛细管电泳（CE）]也被广泛用于蛋白质组学分离。与代谢组分析类似，像LC-MS和CE-MS这样的联用分析方法因其通量和灵敏度而被普遍用于蛋白质组分析。与代谢组学数据分析中常见的预测板相比，蛋白质组学领域通常专注于单蛋白水平，以识别和量化改变的蛋白质表达水平。 

在创伤性脑损伤中，许多候选的蛋白质生物标志物已被独立研究和广泛审查，而且赋予这些标志物意义的机制一般都被很好地理解。因此，我们在这一节的评论中重点介绍了一些主要的候选蛋白质组学生物标志物的例子，它们的功能和特性提供了对TBI后发生的生化变化的洞察力。我们选择了一些主要的蛋白质生物标志物候选者，这些候选者已经被确认为在人类中的水平升高。表2显示了在人类中被鉴定为水平升高的主要蛋白质候选物。

 

表2中显示的大多数候选蛋白质生物标志物是在中度至重度创伤性休克后在血清中检测到的高度中枢神经系统特异性的蛋白质。这些蛋白被称为TBI的外周标志物，因为它们表明（1）中枢神经系统细胞的损伤和（2）BBB的破坏。白细胞介素（IL）-10，一种抗炎细胞因子，被列为TBI非外周标志物的一个代表性例子，因为它在CSF中的上调被认为是对抗TBI后发生的炎症事件。研究最广泛的TBI生物标志物是S100钙结合蛋白β（S100B），到目前为止有超过300份报告。值得注意的是，血清S100B水平在临床上被用来排除轻度TBI，尽管能力有限。 

表2中所列的蛋白质作为诊断指标的一个基本限制是，这些蛋白质没有一个是专门针对CNS的。例如，在中枢神经系统之外，神经元特异性烯醇化酶在红细胞和内分泌细胞中表达，胶质纤维酸性蛋白在Leydig细胞中表达，而S100B在脂肪细胞、软骨细胞和朗格汉斯细胞中表达。因此，强有力的诊断方法必须能够检测出这些蛋白在体内的升高水平，而不是定性的测量。这些蛋白在创伤后血清中的水平升高。循环蛋白水平因人而异，需要记录个人病史，以有把握地测量生物液体蛋白水平的增加，并使蛋白组学诊断的潜力进一步复杂化。在临床环境中使用蛋白质组学诊断的潜力。此外，许多这些蛋白质在非创伤性脑损伤后被观察到水平升高，这引起了人们对单个标记物的特异性的关注，并促使人们使用生物标记物小组。 

候选的蛋白质组学生物标志物进一步阐明了创伤性脑损伤和其他神经系统疾病之间的联系。例如，TBI之后的tau蛋白聚集为TBI作为AD的一个风险因素提供了分子基础。此外，脑缺血与tau的乙酰化有关，这种修饰可导致AD型欧洲病理学的发展。此外，最近观察到，敲除模型中泛素羧基末端水解酶L1的损失可通过抑制糖酵解来挽救PD相关缺陷。除了从生化角度将TBI的一个主要生物标志物与PD联系起来外，这一发现表明，对TBI的病理生理学的多组学理解对于研究TBI与其他神经系统疾病的关系非常重要。 

值得注意的是，尽管通常不被认为是TBI的生物标志物，但在TBI之后，已经观察到与其他神经系统疾病相关的蛋白质的表达水平和定位的改变。例如，慢性创伤后的α-突触核蛋白的积累建立了与PD的额外蛋白质组学联系。尽管我们有能力确定TBI和其他疾病之间相关的蛋白质水平的改变，但我们仍然不完全了解这些疾病的因果关系的机制。例如，尽管在TBI之后观察到了淀粉样前体蛋白（APP）和淀粉样β的积累，但Chen等人并没有观察到AD的淀粉样β斑块的特征。进一步的复杂性来自于考虑到许多这些候选的蛋白质组生物标志物，包括淀粉样蛋白-β和tau，有多种形式，这些形式的相对比例可以传达其他意义。这些发现表明，支配创伤性脑损伤和其他神经系统疾病之间联系的机制可能相当复杂，有必要在多组学学科中进一步研究以澄清这些联系。

转录组生物标志物

转录组学是对单个细胞或细胞家族中所有RNA转录物的研究，包括蛋白质编码的信使RNA（mRNA）和非蛋白质编码的RNA，如转移RNA（tRNA），核糖体RNA（rRNA），微小RNA（miRNA），增强型RNA（eRNA），小干扰RNA（siRNA），P-元素诱导的小睾丸相互作用RNA(piRNA)，小核细胞RNA(snoRNA)，细胞外RNA(exRNA)，小卡雅尔体特异性RNA(scaRNA)和长非编码RNA(lncRNA)。表观基因组学与转录组严格相关，通常被视为转录组学的一个子领域。然而，我们将表观基因组生物标志物的讨论留给本评论的下一节。分析转录组可以深入了解细胞过程的调节，而且由于生物液体中RNA的相对丰度和稳定性，转录组是一个有利的诊断目标。尽管早期的转录组分析采用了基于杂交的微阵列，但现代方法倾向于采用RNA测序（RNA-seq）、实时定量反转录聚合酶链式反应（RT）等技术。转录聚合酶链反应（RT-qRT-PCR），以及NanoStringnCounter等标记探针杂交方法，因为它们具有更好的通用性、一致性和敏感性。现代的微阵列一般都有一个补充技术--通常是RT-qRT-PCR来确认阵列数据的有效性。作为重要的调节器，miRNAs是转录组学方法的关键目标。除了直接的RNA方法，miRNAs还可以通过定量蛋白质组分析来间接研究，有可能提供关于miRNAs调控目标的更深层次的信息，但这些方法具有挑战性。 

与代谢物分析类似，RNA分析目前在创伤性脑损伤领域被广泛探索。特别是，miRNA分析在TBI中具有重要的诊断潜力，显示出对TBI严重程度和损伤反应时间的明确依赖。尽管TBI中的miRNA生物标志物已被广泛审查，但最近的转录组研究已经描述了与脑损伤有关的lncRNA、mRNA和tRNA衍生的小RNA（tsRNA）水平的变化。表3列出了一些主要的转录组候选生物标志物。

 

与表1中的代谢组候选生物标志物类似，表3中所列的转录组生物标志物中，很少有在多个报告中被列为差异最明显的RNA。然而，许多miRNAs在多个研究中被测量出相同的调节（向上或向下），这表明总体上有良好的一致性。有趣的是，miR-92a和miR-451除了是TBI的候选生物标志物外，还被报道为癌症生物标志物候选物，这引起了人们对特异性的关注。值得注意的是，mRNANM_000584编码的IL-8和2个tsRNAs（tRF-SerFCT-078和tRF-Thr-AGT-003）最近被报告为小鼠创伤后的改变；综合来看，这3个候选标志物（涉及神经炎症反应）表明，在创伤后的二次伤害阶段观察到的炎症可能起源于转录组水平。 

TBI的转录组分析显示了100多种RNA表达的广泛、全基因组的改变。虽然目前量化转录组的困难阻碍了转录组的方法，但RNA分析（特别是使用RNA-seq等有针对性的方法）作为了解创伤性脑损伤和相关神经系统疾病的一种手段具有很大的潜力。例如，在CTE、AD和两者的患者中已经发现了突触信号相关基因特征的下调，而且之前已经注意到TBI和其他神经系统疾病之间有许多重叠的海马基因特征。然而，自信地识别基因关联和表达特征是具有挑战性的，而且文献中的结果有时是直接冲突的。随着转录组技术的成熟，它将成为我们了解创伤性脑损伤发病机制的一个重要部分。

表观基因组学生物标志物

 

表观基因组学涉及对影响基因表达但独立于基因本身的修饰的研究。虽然生物体内的所有细胞都含有相同的遗传信息，但基因的表达程度却因细胞类型而异。其中一些细胞特定的表达谱产生于染色质包装的表观遗传调节，如组蛋白修饰、DNA甲基化（DNAm）以及细胞核和线粒体中调节RNA的修饰。DNAm的频率可以取决于序列，其中CpG（5′-CG-3′）位点是甲基化的常见位点。经常与表观基因组学联系在一起的表观转录物组学涉及RNA转录物的调节性修饰，如RNA甲基化（RNAm）。虽然个别表观遗传修饰的基本功能被普遍理解（例如，DNAm抑制转录，组蛋白乙酰化激活转录），但作用于单个基因的多个调节器的相互作用很复杂，受到遗传和人口因素的影响。 

表观基因组学研究通常涉及调查对照组和治疗组之间不同的表观基因修饰和不同的基因表达之间的联系。这些差异通过全基因组的表观遗传学分析和转录组的量化，如亚硫酸氢盐测序或阵列技术评估。为了揭示关联并确定预测能力，可以采用生物信息学辅助的网络和子网络关联分析，统计方法，如PCA，和人工智能方法。TBI的表观基因组学研究相对较年轻，但表观基因组学分析作为评估基因表达改变和深入了解TBI后基因表达改变的具体机制的一种手段，具有很大的潜力。表4显示了TBI的候选表观基因组生物标志物，包括TBI后表达有相关改变的不同甲基化基因。 

目前，不太常见的表观基因组修饰，如泛素化和苏木酰化，仍未得到相对充分的探索，而创伤性脑损伤的表观基因组研究也很罕见。然而，表观基因组是一个有价值的目标，因为从其研究中可以获得对基因调控的深入了解。例如，在表4所列的基因中，DPF3、FOXO3、IRX6、ZBTB16和ZFP219编码转录因子[锌指蛋白DPF3、叉头盒蛋白O3（FOXO3）、易洛魁类顺式结构蛋白6、锌指和（bric-à-brac，tramtrack,广义复合体）结构域的蛋白16和锌指蛋白219]，GADD45G、MORF4L1和RGS1分别编码表观遗传因子（生长停滞和DNA损伤诱导蛋白γ、死亡因子4样蛋白1和G蛋白信号调节器1）。值得注意的是，这个名单包括FOXO3（少数被认为与人类长寿有显著关系的基因之一）、GADD45G（与大脑发育有关）和RGS1（与多种自身免疫性疾病有关），表明TBI相关的死亡率、大脑发育缺陷和自身免疫性可能有表观遗传的影响。虽然这些基因编码的蛋白质通常不被认为是创伤性脑损伤的蛋白质组生物标志物，但它们的功能表明，脑损伤的病理学涉及通过顺式和反式调控作用在转录水平上的改变。此外，表观基因组学进一步证明了在多组学水平上进行分析的必要性，因为表观基因组与代谢组和转录组有着深刻的联系；脑代谢的改变对表观基因组有着直接的影响，而非编码RNA转录物可以影响甲基化状态。 

由于表观基因组学研究在创伤性脑损伤中的稀缺性，很少能得出具体的系统级结论。然而，与N6-甲基腺苷相关的RNAm的改变与TBI和AD有关，在表观转录组水平上提供了两者之间的联系。甲基化的重要性还确定了参与甲基化和去甲基化的酶，如脂肪量和肥胖相关蛋白，作为TBI后的治疗相关目标。最终，表观基因组是一个丰富的信息来源，未来的表观基因组工作将塑造我们对创伤性脑损伤的理解以及与其他神经退行性疾病的潜在联系。 

基因组生物标志物 

基因组学涉及对生物体DNA中包含的一系列基因的研究。基因组可以提供关于一个人患某些疾病的风险的信息，并为个体化治疗方案提供信息。对于由单一基因变异引起的单基因疾病，基因组生物标志物的鉴定可以是直接的。然而，大多数疾病（如AD，PD）是多基因的，受环境因素的影响（主要被认为影响表观基因组），呈现异质性的表型，并且不遵循经典的孟德尔遗传模式。所有这些因素都使识别表明对特定疾病的遗传易感性的生物标志物变得复杂。基因组分析可大致分为全基因组关联研究（GWAS）和候选基因研究。在GWAS中，整个基因组都被考虑在内，没有任何先前形成的关于潜在相关基因的假设，这使得GWAS内在的偏见更少，更全面。在候选基因研究中，对感兴趣的单个基因进行询问，以寻找与特定疾病相关的单核苷酸多态性（SNPs）。由于基因组包含在身体的所有细胞中，几乎所有的样本类型都可以用来提取DNA进行生物标志物鉴定。高通量检测方法的发展，包括SNP阵列检测与荧光标记的寡核苷酸探针杂交的特定等位基因，已经允许大规模收集基因组数据，可用于识别潜在的生物标志物。在使用芯片确定了少数可能与特定条件有关的基因后，可以使用定量聚合酶链式反应（PCR）检测，以获得更高的特异性、敏感性和临床相关性。遗传生物标志物最常见的是通过多重假设检验从基因组关联研究中确定，其中每个单独的遗传标志物都被分析为与某种表型有显著关联。 

众所周知，遗传因素有助于个人出现神经系统疾病的可能性，如AD和PD。对于创伤性脑损伤，基因组生物标志物可能有助于了解一个人的身体将如何应对和从损伤中恢复，有可能导致改进的风险评估、个性化监测和定制的治疗计划。如前所述，遗传变异可能通过影响个体的受伤前状态、神经修复效率和继发性损伤症状，在创伤性疾病中观察到的高度异质性中发挥了作用。表5列出了与TBI后的影响、恢复状态或两者相关的候选基因组生物标志物的选择。 

遗传研究往往在统计能力和人口普遍性方面受到限制，因为小样本大多由出生时被指定为男性的高加索人组成。尽管如此，基因组仍然是一个宝贵的信息来源，可用于预测个体的结果，并深入了解创伤性脑损伤和相关神经系统疾病的生化机制。例如，APOE的ε4等位基因与淀粉样β蛋白水平增加、炎症、运动功能受损、认知能力下降和损伤后BBB修复受损有关。值得注意的是，由APOE编码的蛋白（ApoE）是一个主要的蛋白质组生物标志物（表2），进一步证明了多组学方法的必要性，并确立了ApoE在创伤性疾病中的重要意义。鉴于APP是一种主要在中枢神经系统中表达的整体膜蛋白，ApoE在膜维护和修复中的作用（表5）表明，ε4多态性通过中枢神经系统中的膜失调而导致AD的淀粉样β斑块沉积和神经纤维缠结的发生。此外，正如前面所讨论的，治疗目标自然而然地从生物标志物的识别中出现，因此，参与疾病病理学的分子过程。例如，血管紧张素转换酶抑制剂，如利辛普利（Qbrelis™、Prinivil™和Zestril™；通常用于治疗高血压），目前正在研究作为预防TBI后发生AD的药物。 

基因组是其他多基因组的上游，这意味着基因组对表观基因组、转录组、蛋白质组和代谢组有直接影响。编码区的SNPs在决定功能活性方面起着主导作用，而非编码区的SNPs可以影响基因表达的调节。尽管创伤性脑损伤不会诱发基因组本身的变化，但了解分子水平上的全基因组关联对描述创伤性脑损伤的复杂病理生理学的基础机制至关重要，并可能揭示下游神经系统病症的巧合。 

局限性

我们的审查有几个值得注意的限制。我们只关注TBI中候选生物标志物的身份。尽管对损伤严重程度、时间过程、生物标志物的有效性等方面的考虑对理解创伤性脑损伤很有价值，但这些考虑仍在本综述的范围之外，部分原因是对创伤性脑损伤生物标志物的这些主题的知识普遍缺乏（进一步的信息，见Gan等人的综述中的限制部分）。此外，我们的综述并没有实质性地讨论临床意义，以保持我们对分子水平和机制的理解。因此，关于临床相关的生物标志物参数的讨论，如敏感性、特异性、统计能力和人群普遍性，在这里基本没有。 

这里讨论的生物标志物只限于多组学学科范围内的生物标志物。值得注意的是，在多元组学之外还有一些生物标志物，如无细胞血浆DNA水平和脑电图的功率和相干性，这些标志物已被报道为对创伤性休克具有很高的预测准确性。尽管不完整，多组学提供了一个有用的框架，以了解在TBI期间在分子水平上发生的全系统生物化学变化。

结论

TBI是一个疾病谱，与之相关的生物标志物谱可以根据损伤的严重程度、被考虑的个体的健康史以及损伤和诊断之间的时间线而发生明显的变化。因此，为了理解、识别和治疗创伤性脑损伤，可能需要对这种情况进行多组学评估。最近的TBI生物标志物研究已经导致了许多新的候选生物标志物在多组学学科中的识别。在这篇评论中，我们研究了来自多基因组每个主要组成部分的主要生物标志物候选者。从这些生物标志物的身份中，我们探讨了（1）从这些生物标志物的身份中可以获得对创伤性脑损伤的病理生理学的基本见解，以及（2）创伤性脑损伤和其他神经系统疾病之间的潜在机制联系。从一个强有力的机理理解来看，分子诊断和治疗目标将自然出现，理论上允许对创伤性脑损伤进行更有针对性和有效的临床测试和治疗。 

值得注意的是，多基因组的每一部分都有时间上的依赖性，而哪些重大的生化改变将创伤性脑损伤与其他神经退行性疾病有因果关系的主要问题--如果有的话--仍然是开放的。目前的生物标志物候选物并没有提供足够的信息来充分理解创伤性骨折后发生的复杂的生化变化，也不能自信地确定创伤性骨折和其他神经系统疾病之间的潜在机制联系。此外，目前目标的创伤性休克特异性和人群普适性通常不足以在临床上广泛使用。在撰写这篇综述的过程中，我们发现在对创伤性脑损伤进展的纵向研究方面存在着差距--特别是从分子框架来看。最终，'大科学'的大规模合作努力将继续是必要的，以实现对TBI的整体理解。