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编译：微科盟 蒙奇奇，编辑：微科盟 景行、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载请注明来源于《转录组》公众号。 论文ID 原名：Single-cell sequencing: a promising approach for uncovering the mechanisms of tumor metastasis 译名：单细胞测序：揭示肿瘤转移机制的有前景的方法 期刊：JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY IF：23.168 发表时间：2022年5月 通讯作者：王俊普，欧春麟 通讯作者单位：中南大学湘雅医院 DOI号：10.1186/s13045-022-01280-w 内容 1 前言 在肿瘤转移期间，来自原发性肿瘤的癌细胞通过循环系统或体腔扩散到远处器官。这些肿瘤细胞进一步定植新的部位，在远处器官形成转移部位。多种因素影响着转移性肿瘤的发生和发展，包括遗传因素和体内微环境。转移性肿瘤细胞的基因型和表型往往与原发部位的细胞不一致。肿瘤转移是癌症相关死亡的一个重要因素，因此也是肿瘤治疗的主要障碍。近年来，随着新型诊断技术和治疗方法的引入，转移性癌症的治疗取得了重大进展，但转移性癌症患者的总体五年生存率仍然很低。这可能是由于在癌症的早期阶段没有检测到肿瘤细胞的增殖，因为临床症状往往在晚期才出现。因此，确定转移相关机制、合适的标志物和治疗靶点与转移研究高度相关。 随着高通量测序技术和ChIP-seq平台的发展，单细胞测序（SCS）技术在各种疾病的诊断和治疗方面取得了重大成就，包括代谢、循环系统、神经发育和病毒感染相关疾病以及癌症。SCS技术尤其在肿瘤转移研究中发挥了重要作用。例如，Perone等人用SCS比较了不同细胞的基因组和转录组，发现了罕见的细胞亚群、转移调节因子关键标记分子，以及它们在转移性肿瘤中的定位。Bartoschek等人证明了SCS预测和监测肿瘤转移的能力。Chen等人利用SCS确定了原发性和转移性肿瘤之间肿瘤转移中的差异表达基因，并确定了转移性癌症治疗的靶点。SCS技术与人工智能（AI）相结合，用于液体活检以识别肿瘤的循环细胞，从而为揭示新的转移相关靶点提供理论依据。本综述总结了SCS在肿瘤转移研究中的最新应用，并讨论了SCS在该领域的前景和局限性。作者期望这篇综述能为未来的转移研究和新型转移靶向药物的开发提供重要的视角。 2 单细胞测序（SCS） 2.1 SCS技术的发展 SCS是在单个细胞水平上对转录组学、基因组学和蛋白质组学的研究。在SCS中，对单个细胞的全基因组和全转录组进行扩增，然后进行高通量测序，揭示单个细胞中基因的结构和表达水平。因此，即使是细胞之间的细微差异也可以被分析出来。典型的SCS工作流程包括四个主要步骤（图1）。首先，处理实体瘤样本以分离存活的单细胞（A-B）。然后，将单细胞裂解以获得DNA或RNA，然后扩增以构建测序文库。然后，RNA首先被逆转录为cDNA（C）。准备好测序文库后，就可以在测序平台上执行关键的SCS步骤（D）。测序后，有必要对这些数据进行可视化和解释（E-F）。
图1.单细胞测序示意图。A-B、首先，处理实体瘤样本以分离存活的单细胞。C、然后，将单细胞裂解以获得DNA或RNA，逆转录成cDNA，然后扩增构以建测序文库。D、测序文库制备完成后，在测序平台上进行单细胞测序的关键步骤。E-F、测序完成后，需要对这些数据进行可视化和解释。 自2009年RNA测序（RNA-seq）技术发展以来，SCS已在全球范围内广泛使用。2011年，Islam等人开发了一种单细胞标记的逆转录测序方法，命名为STRT-seq。2012年，开发了一种名为Smartseq的新的SCS变体，并在2013年由Picelli等人改进，他们还开发了Smart-seq2。2017年，10×Genomics作为一种新的单细胞免疫组库测序方法被开发出来。该技术在SCS面向技术和应用方面的测序效率方面取得了重大进展。Azizi等人利用10×Genomics SCS平台分析了来自8名原发性乳腺癌患者的45000个免疫细胞，并揭示了肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的详细表型（图2）。
图2.单细胞测序技术的里程碑时间轴。A、Tang等人于2009年开发了第一种单细胞转录测序技术，即mRNA-seq。B、Islam等人于2011年建立了单细胞标记的逆转录测序方法，即STRT-seq。C、Ramsköld等人于2012年开发了一种新的单细胞测序技术Smart-seq；同年，Hashimshony等人通过多重线性扩增技术开发出单细胞RNA-Seq，命名为CEL-seq。D、Picelli等人在2013年对Smart-seq技术做了一些改进，即Smart-seq2。E、10×Genomics技术作为一种新的单细胞转录组测序方法于2017年被开发出来。 2.2 SCS技术分类 基于对获得的测序数据的分析，SCS可分为三种，即单细胞DNA测序（scDNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞免疫组库测序（scIR-seq）。scDNA-seq和scRNA-seq是两种常用的单细胞测序技术，两者在操作步骤上存在细微差别。scDNA-seq将分离出的单细胞的全基因组DNA进行扩增，而scRNA-seq首先将单细胞的全转录组RNA反转录成cDNA，然后进行扩增；经过分析，可视化数据揭示了细胞群体差异和细胞进化关系。近年来，随着肿瘤免疫治疗技术的发展，scIR-seq受到了广泛关注。在scIR-seq中，以T/B淋巴细胞为研究对象，利用多重PCR技术/5’RACE扩增决定B细胞受体（BCRs）或T细胞受体（TCRs）多样性的互补性决定区域（CDR3区域）。然后将其与高通量测序技术相结合，全面评估免疫系统的多样性，并研究免疫组库与疾病之间的关系。 迄今为止，已经开发了数十种单细胞转录组测序方法，每种方法都有其自身的特点和优缺点。常用的SCS分析方法主要分为7种，即2种低通量平板方法（Smart-seq2和CEL-Seq2）和5种高通量方法（10×Chromium、Drop-seq、Seq-Well、InDrops和 Sci-RNA-seq）。没有一个测序平台适合所有的研究目标（表1）。研究人员应根据各自的研究目的，选择合适的测序平台。 表1.常用SCS方法的优点和缺点。
2.3 SCS在人类疾病中的应用 SCS被广泛用于研究人类疾病，包括代谢、循环、神经发育和病毒感染相关疾病以及癌症（表2）。例如，Farrell等人利用SCS全面分析了阿尔茨海默症患者单个脑细胞的基因表达谱，并鉴别出潜在的疾病相关信号通路，从而为药物开发提供理论依据。此外，Wilk等人利用SCS分析了7名因治疗2019冠状病毒病（COVID-19）而住院的危重患者的外周血单核细胞（PBMCs），并构建了这些患者的外周血免疫反应细胞图谱，以更好地了解COVID-19患者的免疫细胞组成，并协助开发COVID-19疫苗。在人类癌症中，Kim等人基于转移性肺腺癌的单细胞转录组图谱对208506个细胞进行了表征，并确定了一种偏离正常分化轨迹并主导转移阶段的癌细胞亚型。因此，单细胞测序技术的应用相当广泛，可以在各个方面造福人类。 表2.SCS在人类疾病中的应用。
3 肿瘤转移 在转移过程中，恶性肿瘤细胞从原发肿瘤部位通过淋巴管、血管或体腔向身体其他部位扩散。这是一个复杂的多步骤过程（图3），通常包括局部侵袭、内渗、循环、外渗和播撒。 向邻近组织浸润和向远处器官转移是恶性肿瘤的主要特征。肿瘤转移还涉及到原癌基因和抑癌基因的激活和失活，它们调控不同的信号转导通路。例如，MAPK、JAK-STAT、Wnt等其他信号通路与肿瘤转移密切相关。在肿瘤转移前或转移过程中，肿瘤细胞的成分及其周围环境也会发生变化。已证明原发性和转移性肿瘤在肿瘤异质性、耐药性和TME方面确实存在明显差异。一项关于前列腺癌的研究揭示了原发部位和转移部位的相似基因图谱，但也检测到转移部位的额外突变，表明特异性的瘤内异质性。此外，P-糖蛋白（P-Gp）是一种多药耐药（MDR）外排转运蛋白，在癌症进展中的上皮-间充质转化（EMT）期间，其活性会增加。当P-Gp的表达明显降低时，MDR细胞的迁移和侵袭能力明显下降。事实上，转移部位的TME在转移前被选择性激活，从而创造有利的肿瘤生长条件。原发性肿瘤周围的微环境在转移前也同时发生变化，启动细胞的转变以获得某些独特的生物学特性，从而促进转移。TME中的成分和细胞间通讯也可以促进肿瘤形成、转移和耐药性，例如肿瘤相关巨噬细胞 （TAMs）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和EMT。总体而言，肿瘤转移与肿瘤异质性、肿瘤耐药性和TME密切相关。
图3. 肿瘤转移的过程。肿瘤转移是复杂的，涉及多个步骤，即局部侵袭（A）、内渗（B）、循环（C）、外渗（D）和播撒（E）。 4 SCS和肿瘤转移 SCS技术可用于检测肿瘤转移与肿瘤异质性、肿瘤耐药性和TME之间的关系（图4），为揭示肿瘤转移的机制和提出治疗肿瘤转移的新策略提供了良好的平台。
图4.SCS和肿瘤转移。SCS技术可用于研究肿瘤转移与肿瘤异质性（A）、肿瘤耐药性（B）和肿瘤微环境（C）之间的关系。 4.1 SCS和肿瘤转移相关的异质性 在肿瘤的发展过程中，肿瘤之间和肿瘤内部经常出现异质性。因此，基因型和表型的变化存在于同一肿瘤或不同的肿瘤中。更直接地说，原发部位和转移部位之间存在差异。肿瘤异质性是恶性肿瘤的一个重要特征，使肿瘤转移的基础研究、临床诊断和治疗变得困难。在转移过程中，肿瘤异质性反映了原发部位和转移部位在遗传、表观遗传、代谢和免疫反应方面的差异，如免疫浸润程度、免疫和肿瘤细胞类型等。此外，转移部位的肿瘤细胞在转移后往往表现出特异性的驱动突变。例如，在晚期复发性转移性乳腺癌中观察到驱动基因的突变，而在早期原发性乳腺癌中尚未发现这种突变。除了上面提到的空间异质性外，转移的时间维度上也存在异质性。也就是说，同一肿瘤在转移过程中不同时间点的异质性也存在差异。SCS可用于在单细胞水平揭示肿瘤转移相关异质性的遗传、转录和代谢特征。 在转移过程中，参与不同转移相关生物学过程的基因的表达水平不断变化。为此，SCS有助于了解基因表达动态的潜在机制，并揭示原发性和转移性肿瘤之间的遗传、转录和代谢异质性。Okamoto等人利用SCS技术分析了来源于原发性和转移性结直肠癌患者的类器官，发现原发性和转移性病变之间分化细胞标志基因的表达水平不一致，表明转移性病变的基因组成存在差异。Davis等人也利用SCS研究了患者来源的乳腺癌异种移植模型，发现原发性肿瘤和微转移细胞均表现出转录异质性，而微转移细胞具有不同的转录谱。原发性乳腺癌与肺转移癌的代谢表达谱也存在显著差异。对氧化磷酸化的药理学抑制显著减弱了肺部转移性播撒，证明氧化磷酸化在转移中的功能重要性。另一项研究还揭示了胰腺癌原发性肿瘤和转移性肿瘤之间的代谢异质性。骨肉瘤作为恶性程度最高的成骨肿瘤，极易向肺部转移。原发性和肺转移性骨肉瘤的SCS分析显示肺转移性骨肉瘤中的成骨细胞浸润和炎性FABP4 巨噬细胞较低。两种骨肉瘤类型之间免疫细胞类型和比例的差异表明肿瘤的异质性。Ni等人利用SCS发现，来自同一患者的不同CTCs在全基因组中表现出高度一致的拷贝数变化模式，这与同一患者的转移性肿瘤组织的拷贝数变化模式高度一致。在小细胞肺癌和肺腺癌患者中观察到这种现象。首次在CTC中观察到的这种高度一致的拷贝数变化模式可能会改变对肿瘤一致性的传统理解。 肿瘤在时间和空间上也表现出异质性。SCS可以准确地检测出肿瘤细胞在不同时间和不同空间位置异质性的动态变化。事实上，肺癌的多区域SCS分析显示，免疫相关基因在空间和时间维度上具有相当程度的肿瘤内异质性。对卵巢癌患者不同转移部位的类似分析表明，不同转移部位的免疫和间质成分具有相当大的空间异质性。对来自肾细胞集合管癌（CDRCC）的一对原发性和转移性部位的癌症干细胞（CSCs）的SCS分析表明，CSCs可以以时空方式转化为原发性和转移性CDRCC细胞。SCS还被用于重建肿瘤和肿瘤亚克隆发展的历史，识别可能转移的细胞亚型，并可能发现驱动转移和亚克隆发展的基因。Puram等人对18例头颈部鳞状细胞癌患者的原发性和淋巴结转移细胞进行了SCS分析。根据TME中不同类型的免疫细胞和基质细胞，重新定义了头颈部鳞状细胞癌中的分子亚型。具体来说，作者鉴定了一组具有EMT特征的额叶肿瘤细胞，这些肿瘤细胞与淋巴结转移密切相关。三阴性乳腺癌（TNBC）是一种雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子（HER2）均为阴性的独特乳腺癌亚型，具有广泛的肿瘤内异质性，并且预后不良。Karaayvaz等人将SCS分析得到的TNBC>1500的6个主要细胞的基因表达谱进行了聚类分析，结果显示存在不同的肿瘤细胞亚型，包括具有转移和治疗耐药性的肿瘤细胞。利用SCS可以识别容易转移的亚型。Yates等人对转移性乳腺癌患者样本的全基因组进行了测序，结果显示，与原发肿瘤相比，大多数远处转移瘤获得了前所未见的驱动基因突变。SCS还可用于构建肿瘤输注谱和确定转移开始时间。Navin等人利用SCS分析了原发性乳腺癌及其肝转移的100个单细胞。根据他们的结果，单个克隆扩增形成原发肿瘤，引发转移，并意外地形成了未到达转移部位的遗传上的“假二倍体”细胞亚群。在SCS拷贝数变异数据方面，也发现原发部位与转移部位相似。这一发现支持了转移发生在克隆进化后期的假说。 综上所述，上述研究结果表明，SCS可以在单细胞水平上揭示肿瘤内部和肿瘤之间的异质性，识别细胞的特征和状态，识别肿瘤发生和转移的潜在关键因素，从而指导制定精确的治疗方案，绘制肿瘤整体图谱，追踪转移细胞的谱系。 4.2 SCS和肿瘤转移相关的耐药性 化疗是目前恶性肿瘤的主要治疗方法。然而，化疗药物可能会改变肿瘤细胞的表型，导致耐药性。最近的许多研究表明，转移和耐药性之间存在密切关联。例如，CSCs可诱导耐药和转移。CSCs首先转化为原代细胞，然后转化为转移细胞。在转移过程中，CSCs通过EMT和间充质-上皮转化（MET），形成远处转移部位。与肿瘤转移相关的异质性是肿瘤耐药的主要驱动力。转移病灶中细胞的肿瘤基因常包含突变，导致转移后产生耐药性。Jordan等人从原发性乳腺癌患者血液中检测到罕见的CTCs，并鉴定出了转移性乳腺癌中促进疾病发展和治疗耐药性的动态基因表达谱。例如，P-Gp的活性在转移相关的EMT中增加，而P-Gp表达的明显降低导致MDR细胞的迁移和侵袭能力相应降低。因此，通过分析肿瘤细胞耐药性的形成，可以进一步阐明肿瘤转移的机制。 近年来，肿瘤耐药性与转移之间的相互作用已得到证实。长期接触化疗药物极大地促进了肿瘤的侵袭和转移，耐药细胞更容易转移。SCS可用于研究和分析耐药肿瘤细胞，避免肿瘤异质性的干扰，为探索肿瘤转移提供新的视角。前列腺癌患者对雄激素受体（AR）抑制剂有一定的反应。Miyamoto等人对17例前列腺癌患者的单个CTCs进行了SCS分析，发现非典型Wnt信号在耐药患者而非未经治疗患者的CTCs中富集。前列腺癌中Wnt信号成分的表达被证明可以促进前列腺癌的转移。因此，耐药细胞被发现更有可能转移。之前也有研究表明，在耐药的人类乳腺癌（MCF-7）细胞中，一些EMT相关基因的表达水平发生了改变。一项大规模的SCS分析进一步表明，化疗可增加乳腺癌细胞的转移能力。Lee等人对未经处理的紫杉醇耐药转移性乳腺癌进行了SCS分析，发现除了耐药细胞中有特定的RNA变体外，细胞群体中还存在特定的转录图谱。该变体参与微管稳定和细胞粘附，间接表明耐药细胞更容易发生肿瘤转移。在另一项乳腺癌研究中，化疗处理的细胞系中各种单细胞基因表达谱显示，耐药细胞中EMT相关基因的表达上调，主要是由LEF1基因上调。EMT通常被认为是肿瘤转移和耐药的关键因素。因此，化疗会增加肿瘤转移的风险，而耐药肿瘤细胞转移能力的增强与EMT相关基因的上调有关。Nath等人也报道了除了多药耐药（MDR1）基因的高表达外，EMT相关基因也导致了高耐药性。肿瘤耐药性是由细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移所介导的。对6名TNBC患者的肿瘤组织样本进行的单细胞转录图谱分析显示，不同患者共有的恶性肿瘤细胞存在亚克隆异质性，其特点是耐药和转移。简而言之，EMT相关蛋白的上调往往伴随着肿瘤耐药性的增加和耐药细胞的高增殖率和转移率。因此，耐药肿瘤细胞的富集可导致肿瘤转移。Hjortland等人对胃食管腺癌的化疗耐药转移细胞进行了全基因组的单细胞分析，他们分析了耐药转移细胞的分子特征，确定了导致恶性进展的标志物和潜在的治疗靶点。另一项研究讨论了SCS在监测肿瘤中耐药细胞克隆出现方面的可行性。CSCs能够进行细胞分裂，从而在肿瘤中产生异质性，因此在肿瘤发生中发挥了关键作用。对CSCs特性的表征可以提供有关肿瘤转移和耐药性的重要信息。Chen等人用微流控技术富集了转移性乳腺癌细胞，并通过SCS鉴定了转移性细胞中的差异表达基因。发现迁移细胞具有EMT和CSCs的整体特征，但在线粒体形态、氧化应激和蛋白酶体调节因子方面具有不同的特性，揭示了药物治疗的潜在脆弱性和意料之外的后果。Franken等人对46名转移性乳腺癌患者进行了SCS分析，重点分析了CTC的ESR1基因。结果显示，ESR1突变只在转移灶中检测到，而在原发肿瘤组织样本中未检测到。此外，ESR1突变只出现在接受雌激素剥夺治疗的患者中。作者因此得出结论，新发现的突变可能导致靶向耐药性和肿瘤转移。 这些研究表明，SCS可用于分析肿瘤中的耐药细胞亚型，检测关键耐药基因，发现潜在的药物靶点，为改进耐药肿瘤的靶向治疗提供理论依据。 4.3 SCS和肿瘤转移相关的肿瘤微环境 TME和肿瘤之间的关系通常用“种子”（肿瘤细胞）和“土壤”（TME）来描述。TME确实在肿瘤转移中起着不可或缺的作用。肿瘤细胞中具有增殖和侵袭的突变基因的驱动因素与TME在这方面的重要性是一致的。TME相关细胞和分子在肿瘤转移中也发挥着重要作用，如成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞、免疫细胞和细胞因子。Psaila等人首先提出的“转移前生态位”概念表示，原发性肿瘤会在肿瘤细胞到达之前释放一系列信号分子，改变转移部位周围的局部微环境。因此，通过阐明肿瘤转移与TME的关系，分析肿瘤转移前后TME的变化，可以确定在肿瘤发生、发展和转移中发挥作用的关键调控分子。 基于对微环境组成和伴随分子变化的分析，SCS还可用于研究原发性肿瘤和转移性TMEs之间的异质性。Arvanitis等人通过SCS研究了原发性脑瘤和脑转移瘤的血脑屏障（BBB）和血肿瘤屏障（BTB）的特征结构，发现转移性肿瘤和原发性肿瘤的微环境存在结构和功能的异质性。对原发性和转移性肿瘤间BBB/BTB结构和肿瘤细胞亚型的深入研究，有助于更好地了解肿瘤进展和转移，并确定靶向免疫治疗策略。Lee等人利用SCS技术分析了转移性结直肠癌的TME，揭示了CRC分子亚型的细胞成分的多样性及其动态关系，以及CRC的TME景观。Robinson等人对转移性癌症患者的500个转移性和非癌症组织样本的全外显子和转录组进行了基于SCS的分析。这些研究提供了对转移性癌组织中基因组和免疫反应的详细分析，表明了转移性肿瘤的复杂分子景观。SCS还可用于研究TME中与转移相关的基因或细胞类型，包括（但不限于）CAFs和TAMs。Li等人通过SCS分析了结直肠肿瘤及其微环境的转录异质性，发现了两种不同的CAF亚型。EMT相关基因的表达仅在肿瘤组织的CAF亚群中增加，表明CAF可能影响肿瘤的转移和侵袭能力。Bao等人利用SCS分析了TNBC，并表征了肿瘤之间和肿瘤内部的异质性。作者发现肿瘤浸润免疫细胞中巨噬细胞以M2样TAMs为主，并表现出免疫抑制特征。相比之下，M2样TAMs此前已被证明与肿瘤转移密切相关。Winterhoff等人对浆液性卵巢癌组织进行酶消化以去除免疫细胞，通过STS在66个细胞中鉴别出上皮细胞和肿瘤相关基质细胞两个亚群，并表征了这两个亚群的特征。由此发现间质细胞亚群中EMT相关基因的表达增加，为研究浆液性卵巢癌的侵袭和转移提供了新的视角。 最近还强调了TME中的免疫浸润程度和免疫细胞类型在调节肿瘤进展中的重要性。转移部位往往表现出不同的免疫细胞富集模式。因此，了解原发性肿瘤免疫微环境（TIME）的组成和功能及其转移是成功进行癌症免疫治疗的前提。SCS能够识别TIME的异质性和免疫细胞（尤其是T细胞）的特定特征，以设计更好的免疫治疗策略。Zhang等人利用SCS分析了CRC患者和邻近组织的肝转移样本，揭示了来自结直肠癌肝转移中TIME的异质性。本研究中免疫细胞亚型的鉴定使得肿瘤浸润T细胞亚群的分析成为可能，并最终强调了粒细胞在TIME中的作用。该技术还使得识别独特的与转移相关的免疫细胞亚群和潜在的免疫治疗靶点成为可能。 这些研究表明，SCS可用于绘制转移性癌细胞的微环境图谱，分析转移性和原发性肿瘤之间TME的明显结构和功能异质性，以识别转移相关基因或细胞类型。SCS还尤其有助于通过识别肿瘤转移和免疫细胞之间的关系来探索肿瘤免疫治疗的潜在新靶点。 5 SCS在癌症治疗中的应用 SCS在转移性癌症的治疗中具有良好的应用潜力，可用于预测和监测肿瘤转移、阐明转移机制、识别治疗靶点、监测和预测治疗反应、优化治疗策略等目的（图5）。
图5.单细胞测序（SCS）在肿瘤转移治疗中的应用。A、SCS可用于预测和监测肿瘤转移。B、SCS可用于阐明肿瘤转移的机制并提供治疗靶点。C、SCS可用于监测和预测治疗反应并优化治疗策略。 5.1 肿瘤转移监测 目前对肿瘤转移机制的认识非常有限，许多问题缺乏明确的答案，包括原发性肿瘤中哪些细胞亚型或克隆可以扩散和转移，肿瘤细胞可以向远处器官转移多少次，以及是否可以监测肿瘤转移的全过程。随着SCS的最新发展，在寻找这些未解决问题的答案方面取得了进展。 SCS可以预测肿瘤是否会转移，并有助于识别预测转移的标志物。例如，Bartoschek等人对190例远处转移性乳腺癌组织中CAFs的SCS研究表明，不同CAF亚型的标志基因的表达表明人类乳腺癌是否会转移，证实了CAF亚型与肿瘤转移和扩散的相关性。与Bartoschek等人的研究一致，在胰腺导管癌的SCS研究中，如果TME富含新的CAF亚型，则原发性肿瘤具有更高的转移能力。Puram等人通过SCS分析了头颈部鳞状细胞癌的原发性和转移性，发现了一些与部分EMT（p-EMT）相关的明显特征。具体而言，位于原发性肿瘤前缘的细胞中p-EMT水平可作为肿瘤转移的预测标志物。不同时间点的肿瘤，SCS也可用于监测肿瘤发育和进展过程中的罕见突变，如获得侵袭和转移的能力。为此，Davis等人基于SCS和患者来源的乳腺癌异种移植（PDX）模型，开发了一种监测乳腺癌转移过程中若干转移细胞的整体转录组变化的新方法，通过监测细胞转录组的变化和预测患者的不良生存来判断肿瘤是否处于转移过程中。有趣的是，发现这种对转移性前列腺癌谱系的系统基因组分析有助于确定转移是否仅扩散一次还是会发现多次转移。 5.2 寻找潜在的治疗靶点 SCS可通过协助发现与转移有关的基因和细胞亚群以及识别潜在的治疗靶点来分析肿瘤细胞在转移过程中的异质性（表3）。例如，Kim等人使用SCS分析了转移性肺腺癌细胞的单细胞转录组图谱。除了鉴定偏离正常分化轨迹的癌细胞亚型外，他们还鉴定了与肺腺癌进展和转移相关的基因，并强调了ts2特异性相关基因与肿瘤进展和转移有关。这一发现表明，ts2特异性相关基因可能成为转移性肺腺癌新的治疗靶点。Chen等人用微流控技术富集了转移性乳腺癌细胞，然后用SCS鉴定了转移性乳腺癌细胞中的差异表达基因。结果显示，与乳腺癌细胞一起迁移的基因可作为治疗转移性乳腺癌的潜在预后生物标志物和治疗靶点。Xu等人获得了来自原发性肿瘤、阴性淋巴结（NL）和阳性淋巴结（PL）的单细胞的基于SCS的转录组图谱。他们还对PL和NL样本进行了转座酶可及染色质 （ATAC）测序（scATAC-seq）的单细胞分析。结果显示，在乳腺癌患者的PL中出现了一个新的细胞亚群，其CXCL14的表达水平异常高。scRNA-seq和scATAC-seq的综合分析显示，CXCL14是乳腺癌中淋巴结转移的关键调节因子。Lawson等人通过SCS分析了不同阶段的转移性乳腺癌的基因表达，发现早期病灶转移性肿瘤细胞的基因表达水平与原发性病灶存在着显著差异。此外，他们还在原发性肿瘤中发现了少量干细胞样克隆亚群，并检测了早期病理改变的转移性肿瘤细胞中各种干细胞基因的表达，证实这些细胞可以分化为体腔转移细胞，从而阐明干细胞样克隆亚群在乳腺癌转移中的作用。综上所述，有必要针对具有转移倾向的细胞亚群或基因寻找相应的药物靶点，以实现靶向治疗，改善早期和中期癌症患者的预后。 表3.单细胞测序在人类癌症中的潜在应用。
SCS还可以识别转移机制的细节，有望为肿瘤转移治疗提供治疗靶点。Gundem等人利用SCS对10例前列腺癌引起的多个转移组织进行了表征，并综合分析了亚克隆系统的特征。研究发现，AR信号转导基因突变通常出现在不同的转移灶中，揭示了转移机制的前所未有的细节，进一步阐明了转移到远处器官的机制。值得一提的是，SCS还可以解释转移性癌症的代谢理论。Davis等人强调乳腺癌细胞在转移过程中利用线粒体代谢，这些靶向线粒体的药物可以有效地防止癌细胞转移。作者还通过SCS分析了原发性乳腺癌及其微转移的转录组图谱，并确定肿瘤转移上调的主要机制是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），这表明，选择性抑制OXPHOS可能是防止乳腺癌转移的一种新的靶向治疗策略。利用SCS研究肿瘤环境中免疫细胞群的组成将有助于确定有前景的癌症免疫治疗靶点。Zhang等人利用SCS分析来自结直肠癌患者肝转移组织及邻近组织样本，进一步研究结直肠癌肝转移的微环境组成及特征，共鉴定出6种细胞类型对应的12个簇。本文讨论了93个细胞簇特异性紊乱基因（CCSDGs）在肿瘤浸润免疫细胞中的临床意义。发现Wnt信号通路被激活并促进了粒细胞的迁移。SCS分析也有助于阐明TME的组成和CRC肝转移的机制。同样，对转移性黑色素瘤微环境中肿瘤浸润T淋巴细胞的SCS分析显示，肿瘤组织中存在T细胞激活和克隆性扩增。单细胞基因组学为靶向治疗和免疫治疗提供了进一步的见解。Zhang等人利用SCS分析了包括肾透明细胞癌（ccRCC）在内的所有细胞亚群的肿瘤异质性。作者对121个细胞样本进行了表征。他们发现了44个转移相关标记基因，并验证了14个关键转移相关基因（MAGs），证实了MAGs与多种风险预后相关。此外，具有高MAGs列线图评分的患者与ccRCC中氧化磷酸化、Wnt信号通路和MAPK信号通路的上调有关。因此，SCS可能对于识别转移性ccRCC中的潜在药物靶点很有价值。 随着SCS技术的不断进步和CTC富集和鉴定的标准化，CTCs的SCS可用于比较原发性、转移性肿瘤和转移性淋巴结中单细胞的基因组成、转录和表观基因组的差异，从而确定潜在的治疗靶点，发现转移相关的细胞亚群或突变基因。Aceto等人使用SCS分析了来自带有标记乳腺癌的小鼠模型的CTCs，发现与单个CTCs相比，罕见的CTC簇表现出更高的转移潜力。此外，人类乳腺癌CTC簇的RNA测序证实了盘状球蛋白在肿瘤细胞集群形成中的关键作用。在小鼠模型中，盘状球蛋白的敲低消除CTC簇的形成并抑制肺转移，表明盘状球蛋白可能是转移性乳腺癌的一个关键治疗靶点。Ting等人从胰腺癌小鼠模型中分离出CTCs，分析单个CTCs的全基因组表达谱，并通过SCS匹配原发性肿瘤。在小鼠和人胰腺癌CTCs中发现细胞外基质（ECM）相关基因分泌的酸性和富含半胱氨酸（SPARC）的蛋白的高表达，该基因也被证实与胰腺癌转移密切相关。敲低SPARC可抑制细胞迁移和侵袭。因此，SPARC有望成为胰腺癌治疗的新靶点。 AI产业的发展为SCS技术提供了更简单、更具有视觉吸引力的解决方案。例如，AI可以广泛应用于SCS工作流程的各个方面，例如技术异质性的批量校正、特征提取、数据分布转换、癌症亚型分类和生物标志物鉴定。最值得注意的是，SCS与AI结合也被广泛用于识别和分析CTCs，这是一类可用于寻找肿瘤转移治疗靶点的细胞。例如，基于AI的细胞鉴定技术“Deepcell”可用于活细胞的形态学鉴定，以协助单细胞基因组学和液体活检。此外，MagRC是一种新的AI 技术，能够区分全血细胞中的CTCs并对异质性CTCs进行分类。这种与AI的结合使用可以更全面地分析CTCs，不受操作者之间干扰的影响，因此有望成为识别转移相关标志物和治疗靶点的重要工具。因此，与AI相结合，SCS将成为利用基因组大数据中可用信息并最终“提供”精确治疗的关键工具。 综上所述，SCS可用于挖掘与肿瘤转移相关的治疗靶点，为基础研究人员寻找潜在的药物治疗靶点提供理论依据。随着AI的结合应用，CTCs的挖掘变得更加深入和便捷。 5.3 监测治疗反应和优化治疗策略 肿瘤异质性给癌症治疗带来了复杂的挑战，并且是治疗反应和转移的关键决定因素。转移性肿瘤与原发性肿瘤在细胞增殖率、侵袭和转移能力等方面存在差异，进而导致治疗反应和预后的差异。恶性腹水可由包括CRC在内的多种癌症的转移引起。Poonpanichakul等人利用SCS研究并鉴定了来自4名CRC患者的19653个腹水衍生的细胞。这些细胞的无偏聚类显示了在四种主要细胞类型中具有独特转录组模式的14个亚群：上皮细胞和骨髓细胞、成纤维细胞和淋巴细胞。对上皮细胞亚群的分析显示，11个亚群中只有3个亚群在治疗后显著收缩，这表明大多数异质性腹水衍生的细胞对治疗具有耐药性。因此，研究者在单细胞水平上确定了一个高度异质性的癌症亚群。换句话说，不同的细胞类型对化疗的反应不同。总的来说，本研究强调了SCS在实时监测癌症患者治疗反应方面的潜在益处。仅仅研究原发性肿瘤的表型可能会导致不良的治疗选择。CTC表型的早期发现和表征有助于优化药物治疗策略和监测治疗反应，因为已确定的CTCs基因表达特征与肺癌、乳腺癌和前列腺癌的治疗反应和转移风险有关。Miyamoto等人用SCS分析了前列腺癌患者外周血中的77个CTCs，发现CTCs中的基因表达存在异质性。基于这一发现，对患者的雄激素受体（AR）抑制剂的治疗反应进行了回顾性分析。结果显示，在接受AR抑制剂治疗的患者中，CTCs中的细胞信号通路受到了影响。作者将这一发现归因于患者的治疗反应，而SCS确实被证明可以反映肿瘤的治疗反应。Su等人使用SCS追踪和分析小细胞肺癌（SCLC）治疗过程中不同时间点CTCs的拷贝数变化（CNA），发现根据治疗前的初始CNA得分可以预测患者的生存期。因此，CNA评分越低，表明生存时间越长，治疗反应越好。因此，监测化疗期间不同时间点CTCs的CNA评分可用于评估治疗反应。Shih等人通过高通量SCS分析研究了来自高级别浆液性卵巢癌患者的原发性和转移性肿瘤组织样本。他们的结果显示，CD24、EPCAM、KRT18基因在原发肿瘤的上皮细胞中显著表达，而相应的转移病灶在T和B细胞簇中显示出CD44的高表达。CD44表达升高曾被证明是浆液性卵巢癌患者总生存期（OS）缩短的独立预后指标。Schulz等人利用SCS分析了脑转移瘤微环境中小胶质细胞和血源性单核细胞的变化，揭示了不同脑转移瘤阶段和对放疗反应的髓质区的细胞和分子变化，这表明SCS也可用于监测脑转移瘤中的治疗反应。SCS的另一个潜在应用可能是研究肿瘤衍生的外泌体（TEXs）。外泌体是一类小的细胞外囊泡，与肿瘤转移和治疗反应等生物学现象有关。SCS可用于TEXs中的RNA测序，从而纵向监测循环外泌体中的RNA表达谱，研究免疫治疗过程中免疫通路基因的变化以及应答者和非应答者之间的差异表达模式。SCS技术在表征这些复杂的微囊泡方面的潜力很有前景。Fathi等人使用SCS证实，与细胞外囊泡（EV）分泌有关的途径在非转移性细胞中（与转移性细胞相比）富集。对体外实验和动物研究结果与使用这些细胞系获得的结果进行分析表明，与非转移性乳腺肿瘤中CD81 CD63 EVs特征较少的肿瘤相比，富含CD81 CD63 EV特征的肿瘤具有更好的预后。可见，研究TEXs有助于监测肿瘤患者的治疗反应，推断肿瘤患者的预后。 SCS还可用于识别新的标志物，以预测治疗反应。Wang等人利用SCS研究了高密度和疏松胰腺导管腺癌（PDAC）的肿瘤异质性，发现富含meCAFs的PDAC患者转移风险更高，预后较差，但对免疫治疗的反应较好，这表明新的CAF亚型可以作为治疗反应预测的生物标志物。胃腺癌（GAC）肿瘤细胞转移至腹膜癌（PC），但腹膜癌发病的基本机制目前尚不清楚。Wang等人对44例PC患者的全外显子和转录组进行测序，确定了PC的两种主要分子亚型，即“上皮样”和“间充质样”，它们对化疗的反应不同，因此可以用来预测治疗反应。Fairfax等人利用SCS对一组使用检查点阻断剂治疗的转移性黑色素瘤患者的CD8 T细胞的基因表达进行了表征。他们的结果显示，外周血中的CD8 T克隆可用于预测对检查点阻断的长期反应。研究者还进行了基于预测转移相关因素的药敏实验，以预测治疗反应。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的肾细胞癌。Kim等人应用SCS检测了一对原发性肾细胞癌及其肺转移瘤的瘤内异质性。他们发现，基于EGFR和SRC的高表达水平，可以考虑将其作为转移性肾细胞癌联合靶向治疗的靶基因。此外，还预测了单个肿瘤细胞的药物敏感性，并确定了具有不同药物敏感性和信号通路激活谱的四个转移性肾细胞癌（mRCC）亚群。最后，预测了针对两种相互排斥路径的组合策略方案。在这一策略中，转移性癌细胞是基于多种药物靶标途径的激活而衍生的。因此，在转移性肾细胞癌中，联合治疗策略被证明优于单一疗法。 这些研究表明，SCS在监测和预测转移性肿瘤的治疗反应，以及筛选新的分子标记物，以进一步优化临床药物治疗方案方面具有潜力。 6 挑战 尽管在SCS领域已经取得了很大的进展，但由于以下因素，该技术仍然具有挑战性，远未被常规使用：（1）单细胞收集非常棘手。使用少量的样品材料，但分析仍然需要足够数量的细胞，以确保所有细胞类型都被标记；（2）样品分离方法和储存方法尚未完全、全面建立。分离技术可能造成细胞损伤；因此，需要细心的操作和实践经验；（3）扩增产物的质量和效率存在差异。当用不同的测序平台检测同一样本时，由于每个平台的PCR扩增效率不同，结果也会不同。此外，由于每个细胞中包含的DNA或mRNA的数量非常少，因此需要首先进行全基因组或全转录组扩增步骤。主要表现在两个方面:（i）难以实现真正的全基因组扩增。因此，基因组中的一些区域被扩增，而另一些区域没有被扩增，没有被扩增的区域无法测序；（ii）两个样本的基因表达水平相同，但扩增效率不一致。经过N个循环的扩增，两个样本扩增后的表达谱会有很大差异。在分析差异基因时，如果选择1.5倍作为差异基因的标准，则基因之间可能存在虚假差异；（4）技术成本高。SCS的使用受到限制，部分原因是其成本高和操作时间长。所需的大部分仪器和试剂都很昂贵；（5）SCS数据分析难度太大。 随着实验规模的扩大，数据分析的负担也随之增加。此外，当数据过多时，计算机运行缓慢，不方便下载和保存。面对这些限制，SCS技术在临床诊断、治疗指导和治疗监测中的大规模应用潜力还有待进一步检验。总而言之，作者期待这些瓶颈将在不久的将来随着技术的进步而被克服。 结论与展望 2011年，《自然方法》杂志将SCS列为值得期待的新兴技术之一。2013年，《科学》杂志将SCS列为年度最值得关注的技术。2018年，SCS再次位列《科学》十大科学突破之首。2020年，多家研究机构合作，基于SCS数据对人类肿瘤图谱网络 （HTAN）进行了表征。此外，文献表明，未来SCS在基础科学研究、临床医学等多个研究领域具有无限的应用潜力，并将影响未来科学发展的方向。本文综述了SCS技术在肿瘤转移研究方面具有良好的应用潜力。它可用于绘制单个肿瘤细胞的综合图谱，准确比较不同肿瘤细胞（例如来自原发性和转移性肿瘤的细胞）的异质性，用于预测和监测肿瘤转移，阐明转移机制，确定治疗靶点，监测和预测肿瘤转移，优化治疗策略。SCS最有前景的应用是通过识别CTCs来分析肿瘤转移。使用SCS结合AI来识别CTCs和潜在的肿瘤转移机制是“锦上添花”。综上所述，SCS在克服肿瘤转移方面具有广阔的前景，有望为肿瘤转移提供新的治疗靶点。 |
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