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写在前面 当初让他们看下这篇文献的原因是可以指导目前大规模筛选代谢物的实验，这里显然进行700多种代谢物对微生物成膜作用的筛选，然而这里写的非常简单，无法进行具体的实验指导。例如需要的代谢物配置信息，添加信息等。
文献题目：水稻黄酮生物合成的基因修饰促进土壤固氮菌的生物膜形成和生物固氮 英文题目：Genetic modification of flavone biosynthesis in rice enhances biofilm formation of soil diazotrophic bacteria and biological nitrogen fixation DOI：https:///10.1111/pbi.13894 第一作者：Yan Dawei 通讯作者：Eduardo Blumwald 关键词：生物固氮，水稻，化学筛选，生物膜，芹菜素，微生物群 研究背景： 氮是植物生长的必需元素之一。植物不能直接利用大气中的氮气，它们从土壤中吸收无机态的氮如铵盐和硝酸盐。现代农业严重依赖施用化肥来提高生产力，而施用的氮肥约有一半通过挥发进入大气而流失，导致温室气体排放增加和全球变暖。氮肥也从土壤剖面渗入地下水，导致水体富营养化。随着氮肥的使用，公共水资源的硝酸盐污染显著增加，并可能对人口健康构成严重挑战。因此越来越需要发展可持续的替代品，以减少无机氮肥的使用。例如通过生物固氮将大气中的N2转化为氨，从而减少农业生产对氮肥的需求。关于谷类植物固氮工程化，已经有两种主要的实验策略：控制细菌固氮酶基因在植物中的表达，在谷类作物中发展豆科类根瘤共生。 植物根系与富含微生物的土壤环境之间的相互作用对植物适应性至关重要。据估计，植物中高达20%的固定碳会释放到根际，这其中包含的许多化合物(有机酸、氨基酸、酚、次生代谢产物等)能参与塑造根际和根中的微生物群落。生物膜的形成也支持土壤中的根-细菌相互作用，生物膜是细菌自产的含有多糖、蛋白质和脂质的胞外聚合物基质。在某些情况下，生物膜的形成对成功的根系定植至关重要。作者关注根系分泌物对微生物的成膜作用 研究目的： 通过对水稻进行基因改造，以期促进谷类植物的生物固氮并增加粮食产量，替代部分无机氮肥的施用。 研究方法： 水稻品种Kitaake日本粳型常规水稻。土壤购自黑斯蒂的国会山砂土和砾石(加利福尼亚州萨克拉门托)，其成分如下：25%的筛选表层土、5%的熔岩细粒和沙子以及70%的等量森林腐殖质，有机堆肥，蘑菇堆肥。 首先进行化学筛选，以确定在固氮醋杆菌中诱导生物膜形成的化合物，并证明芹菜素和其他黄酮能诱导细菌生物膜合成和生物固氮。然后，使用基于CRISPR的基因编辑来修改水稻中的黄酮生物合成途径，生成富含芹菜素的水稻植株，促进根际分泌芹菜素。 统计分析：单变量和多变量统计检验植物基因型是否显著改变了植物相关细菌群落。基因型之间ASV丰富度的统计差异使用Wilcoxon秩和检验确定。使用排列方差分析确定植物隔间和基因型的因子显著性，并使用主坐标分析进行可视化。为了确定各个属在基因型之间是否存在差异丰度，我们使用R包DESeq2中的离散度收缩估计计算了负二项分布的广义线性模型。使用Benjamini-Hochberg对Wald检验P值进行调整，以进行多重比较。基因型对假定固氮菌相对丰度的影响通过三个根室的Wilcoxon秩和检验进行评估。以植物区系和基因型为因子，通过双因素方差分析对预测的固氮菌丰富度进行建模。当构建线性模型时，通过Quantile-Quantile Plot作图，ShapiroWilk进行正态性检验，数据满足正态性假设。 研究内容： 结果一：使用化学筛选来鉴定对细菌生物膜形成起促进作用的化合物
图S1化学筛选和hits验证的工作流程 图S1a、固氮醋杆菌用于高通量筛选能够诱导生物膜形成的化合物。选择固氮醋杆菌进行筛选是因为其生物膜染色背景低，并且生物膜在细菌与宿主植物之间建立互惠关系中起着不可或缺的作用。 图S1b,c、芹菜素、木犀草素和1C08化合物对生物膜形成均有显著的促进作用，但芹菜素和木犀草素对于微生物生长效果不明显，1C08能促进微生物生长。
图1 化学筛选鉴定芹菜素和木犀草素作为固氮细菌的生物膜诱导剂 图1a、对740种化合物进行了筛选，确定了生物膜产生的正调节因子和负调节因子。 图1b、前21个正相关点的层次聚类表明，这些化合物的大多数都至少有一个苯环，类黄酮的比例过高。在正相关性最高的结果中，选择了黄酮芹菜素和木犀草素进行进一步研究，因为它们的植物起源和在豆科-根瘤菌共生中的已知作用，以及水稻中成熟的生物合成途径。 图1c,d、生物膜的形成仅由木犀草素和芹菜素诱导，而不是由前置的柚皮素或后置的金圣草素诱导。
图2 芹菜素和芹菜素-O-葡萄糖苷体外诱导生物膜并促进固氮 图2a、黄酮类化合物通常以更稳定的糖苷形式储存在植物中，因此还测试了两种芹菜素糖苷对生物膜形成的影响；芹菜素-7-O-葡萄糖苷有促进作用，而芹菜素-6-C-葡萄糖苷没有影响。芹菜素或芹菜素-7-O-葡萄糖苷可以诱导其他固氮营养体的生物膜，包括普通固氮弧菌、伯克氏菌和巴西固氮螺菌。 图2b、使用共焦显微镜观察芹菜素或芹菜素-7-O-葡萄糖苷存在下的生物膜形成。由gumD启动子驱动的绿色荧光蛋白是EPS生物膜基质的标记物，被引入组成性表达mCherry的固氮醋杆菌(genpro::mCherry)。在芹菜素或芹菜素-7-O-葡萄糖苷处理的细菌中观察到gumDpro::GFP的高表达，表明基质和生物膜形成增强，证实了结晶紫定量报告的诱导生物膜形成的化合物的筛选。化学诱导的生物膜形成有利于生物固氮。 图2c、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷处理固氮醋杆菌的均显示出比DMSO处理更高的固氮活性。 结果二：CRISPR技术选育富含芹菜素的水稻品系
图3 CYP75B3/CYP75B4敲除植株在根和根分泌物中积累芹菜素 图3a,b、水稻只有两个编码类黄酮3’-羟化酶的基因，即CYP75B3和CYP75B4，它们介导芹菜素转化为木犀草素。试验设计了同时靶向CYP75B3和CYP75B4的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)sgRNA，并转化到Kitaake水稻中。对转化的crispr后代的测序显示，有几个株系在基因组的靶区发生突变。例如，crispr#85和crispr#87均具有截短的CYP75B3，其提前终止密码子位于+493bp，以及截短的CYP75B4，其提前终止密码子位于+487bp。第三个等位基因crispr#104具有移码突变、截断的CYP75B3，其提前终止密码子位于+736bp，以及截断的CYP75B4，其提前终止密码子位于+487bp。 图3c、qPCR证实，crispr处理植株几乎没有CYP75B3和CYP75B4的转录本。 图3d,e、crispr水稻处理植株的根提取物和根分泌物中芹菜素的含量显著高于Kitaake对照植物。在根提取物中，芹菜素苷元比芹菜素-7-O-葡萄糖苷更丰富。
表S3 引物列表 CRISPR构建体包含3个同时靶向CYP75B3和CYP75B4的sgRNAs。 结果三：crispr水稻品系分泌更多芹菜素，促进固氮醋杆菌生物膜的形成，增强体内生物固氮，提高种子产量。 渗出液中芹菜素苷元与其糖苷的浓度不断变化，可能是根际微生物群的复杂酶反应和微生物糖苷酶的作用。
图4 crispr处理植株诱导更多的生物膜并固定更多的氮 图4a、与Kitaake提取物相比，crispr植物提取物诱导固氮醋杆菌形成了更多的生物膜。且尽管不同制剂的根提取物对细菌生物膜形成的影响不同，但crispr处理植株提取物诱导形成的生物膜始终多于Kitaake对照提取物。 图4b、crispr处理植株根系分泌物诱导固氮醋杆菌形成的生物膜同样多于Kitaake根系分泌物诱导的。 图4c、水稻crispr植株的根诱导固氮醋杆菌中gumDpro::GFP的表达高于Kitaake植株，表明编码胞外多糖(EPS)的gumD的转录增强，对生物膜的形成至关重要。 图4d、为了评估由根系分泌物诱导的生物膜生成增强是否促进了与根系相关的细菌的固氮活性，通过同位素比值质谱IRMS测量了15N二氮气体在根系中的同化。在水稻发育的两个阶段：分别在8周龄和16周龄植株的穗形成和成熟植株中测量了15N同化物。水稻crispr植株在两个发育阶段都表现出15N含量的大幅增加，表明土壤细菌固定在氨上的15N2增加，并被水稻植株同化。成熟植物根系吸收的15N量相对较低可能是由于成熟植物的氮同化减少，其中谷物中的大部分氮主要来自叶绿体蛋白质降解的成熟器官(叶和茎)。 crispr植物根系分泌物中的芹菜素能诱导生物膜形成增加，这一过程与土壤与固氮细菌结合的过程具有显著的相关性，而生物膜有助于维持低氧条件，从而提高固氮酶活性，促进固氮菌对大气中氮的固定。
图S2在22.5ppm氮条件下生长的75天生crispr处理植株的农艺性状 Kitaake和crispr水稻品系之间的农艺性状(茎干重，根干重，总干重，叶面积，冠根数，根长，气孔导度，蒸腾速率，光合作用强度，叶绿素a含量，叶绿素b含量，总叶绿素含量)没有显著差异。
图5 crispr处理植株在氮限制条件下产生更多种子 为了评估生物固氮是否有助于水稻植株的氮同化，Kitaake和crispr植株在控制(75 ppm N)和限制(22.5 ppm N)氮条件下生长。在成熟阶段，相比于Kitaake对照组，所有crispr处理植株表现出较短的表型，株重下降，穗数增加，种子产量增加20%-35%。
图S3不同施氮条件下产量和种子含氮量的比较 相比于Kitaake对照，crispr处理植株在80%沙土/20%泥炭土混合土壤，75 ppm N条件下株重下降，种子重量下降，除#85组外穗数也减少。而在混合蔬菜土，25 ppm N条件下crispr#87处理植株的穗数、种子重量显著高于对照。crispr处理植株每克种子的总氮含量等于或高于对照组，使得每株的氮含量更高。 结果四：富含芹菜素的水稻为生物固氮招募了一个独特的微生物群
图S4从crispr处理植株分离的潜在固氮细菌对芹菜素发生反应 图S4a、在芹菜素存在的情况下，测试了在Jensen的无氮培养基(使用大气氮气作为唯一氮源)上生长的80个菌落。与对照组相比，在芹菜素存在的情况下，42.5%和67.5%的菌落产生更多的生物膜。通过使用16S简并引物对进行PCR测序，并在数据库中搜索：https://www./identifite，对每种细菌进行鉴定。 图S4b、用Bray-Curtis距离测量的主坐标分析从数据集中移除27个散装土壤和根际样本，用圆圈标出。这些数据点偏离了细菌组成从土壤到根际、根面和内生层的逐渐转变，这是因为植物选择性过滤相关微生物，所有后续分析都不包括这些数据点。
图6 crispr处理植株为生物固氮招募了一个独特的微生物群 图6a、对于α多样性，无论植物基因型如何，ASV(代表单个样本中的物种或菌株数量)的丰富度在更靠近根部的地方下降，表明寄主植物预期会进行强烈选择。Wilcoxon秩和检验表明，在测试的三个根室中，Kitaake和crispr处理植株的ASV丰富度没有显著差异。 图6b、通过PCoA测量的β多样性表明，植物基因型在形成微生物群中起着重要作用。非根际土、根际、根表和内生层的样本彼此分离，表明了它们的差异。 图6c、基于Bray-Curtis距离的主坐标分析PCOA表明，在根际、根表、根内这三个根室中，crispr植物招募的微生物群与Kitaake对照植物分开聚集。当在PerMANOVA中考虑细菌群落组成中的根室和基因型的显著性时，这两个因素在P<0.001时都是显著的，但没有显著的交互作用。 图6d、在整个实验中分类的423个细菌属中，7个属的丰度在与crispr植物基因型相关的一个或多个隔间中较高，而11个属的丰度相对于Kitaake基因型较低。 图6e、植物基因型是模拟预测固氮细菌丰富度的一个重要因素，crispr植物在所有三个根室中的固氮细菌ASV丰富度均显著高于Kitaake对照。
图S5 Kitaake和crispr处理植株的根微生物群比较 图S5a、整个实验的细菌库由43个门的细菌组成，其中最丰富的门包括变形菌门(63.1%)、拟杆菌门(9.4%)和粘球菌门(5.3%)。 图S5b,c、大于0的值表示crispr基因型相对于Kitaake具有显著更高丰度的顺序或家族；而小于0的值表示crispr基因型丰度显著较低。在三种根室中，crispr处理植株在目和科层次上相对于Kitaake对照均具有显著不同的丰度。
图S6 FAPROTAX预测的固氮细菌 图S6a、植物基因型是模拟预测固氮细菌丰富度的一个重要因素，crispr植物在所有三个根室中的固氮细菌ASV丰富度均显著高于对照植物。 图S6b、Wilcoxon秩和检验表明，crispr植物中假定的根内固氮细菌的比例显著较高，crispr基因型的平均比例为0.85%，Kitaake基因型的平均比例为0.66%。在根表或根际的植物基因型之间，固氮细菌的相对丰度没有显著差异。 讨论： 植物根系分泌物诱导土壤细菌生物膜形成，并促进产生微需氧条件，提高土壤中固氮细菌的固氮活性，为植物提供氨。本研究应用化学筛选方法，设计了针对细菌生物膜形成的天然、合成化合物的功能筛选，鉴定出特定化合物并修改其生物合成/降解途径使相应化合物在植物根系中积累并释放到根际。 本研究确定了几种促进固氮醋杆菌中生物膜形成的类黄酮化合物。类黄酮由植物根系释放到根际，在控制植物-土壤互作方面发挥着作用，也是豆科植物和根瘤菌之间的共生的关键因素，可诱导根瘤菌Nod基因，该基因是根瘤形成的信号。芹菜素和7,4′二羟黄酮是Nod基因最有效的诱导剂之一，并已被证明能从根冠释放的根缘细胞中积累。在玉米中，自交系787已被证明可增加黄酮合酶的表达，并分泌出约5倍的芹菜素和木犀草素，促进根际草酸杆菌的富集，改善氮限制条件下的植物性能。芹菜素对几种固氮细菌生物膜形成的影响因物种而异，但在所有情况下都是起促进作用的，这表明芹菜素可以作为固氮细菌生物膜形成的一般刺激剂。生物膜使游离的固氮斯氏假单胞菌A1501和巴西固氮螺菌能够在自然需氧条件下固氮，且固氮醋杆菌的生物膜生成与固氮活性增加相关。 本研究预计，通过抑制芹菜素分解代谢，可以增加水稻芹菜素含量和根分泌出的芹菜素数量。应用CRISPR/Cas9方法敲除CYP75B3和CYP75B4基因，编码类黄酮3’-羟化酶，介导Kitaake水稻植株中芹菜素转化为木犀草素，增加根提取物和渗出物中芹菜素和芹菜素O-葡萄糖苷的含量。芹菜素分解代谢的工程化导致其他黄酮类化合物(如曲霉素)的减少。 检测植株体外生物膜诱导所需的芹菜素浓度大于在体内诱导生物膜形成和有效固氮所需的芹菜素浓度。许多因素可以解释这些差异；(1)体外测量在2天后进行，而crispr植物连续分泌芹菜素，(2)芹菜素可以以更高的浓度在根表面随时间空间累积，(3)芹菜素的溶解度有限，(4)根分泌物中的其他代谢物也可能有助于细菌生物膜的形成等。芹菜素在促进crispr水稻植株根室生物膜形成和诱导生物固氮中的作用得到进一步验证，当植株在限制氮条件下生长时，产量增加20-35%。 在对照和限制氮条件下观察到的植株株高降低可能与类黄酮诱导的木质素动态平衡变化有关。编码CYP93G1的黄酮合酶II的水稻突变体催化柚皮素转化为芹菜素，也显示出较短的植物表型，表明crispr处理植株的高度表型不是芹菜素积累的结果。在对照条件(75ppm)下生长的cripsr处理植株表现出相似的表型，但产量没有增加，这表明在限制性氮条件(25ppm)下的产量增加与高度表型无关。在限制氮条件下生长的crispr水稻表现出高度降低、分蘖数增加和粮食产量增加的特点。 研究结果表明，芹菜素分解代谢对根微生物群α多样性的影响有限，因为Kitaake植株和crispr植株根室中的细菌变异丰富度相似。然而，与Kitaake植株相比，crispr植株在根际、根表和根内中形成了一个独特的微生物群，具有更高的固氮细菌。由于土壤微生物群受环境因素和土壤生境相关因素的影响很大，在两种截然不同的土壤“混合蔬菜土”和“80%沙土/20%泥炭土混合物”中获得的类似结果表明，crispr植株对环境具有很强的适应性。 接种固氮细菌在该领域的成功率有限，部分原因是接种剂被植物根际的本地微生物群落所超越。我们的工作不是提高某些接种细菌的存活率和活性，而是通过诱导其生物膜为本地固氮细菌定植创造更好的条件，这对细菌存活、定植宿主和维持固氮酶活性至关重要。由cripsr处理植株产生的富含芹菜素的微环境可能选择性地诱导土壤固氮细菌的生物膜形成，提高其在宿主植物中的定植能力。 研究结论 ： (1)在限制土壤氮素条件下，基因改造导致的根系分泌物黄酮含量的增加，可以提高固氮细菌的生物膜产量，引起生物固氮的增强和粮食产量的增加。 (2)生物膜的产生还改变了根微生物群的结构，使固氮细菌在根内、根表和根际富集。 (3)基因改造调控黄酮的生物合成途径是一种诱导谷类植物生物固氮的可行的通用策略。 该研究创新性十足，摒弃改造固氮酶基因、注射接种菌剂这类直接影响生物固氮的措施，开发了一种新方法，通过基因改造，先增加了某些化合物的含量，再刺激土壤中固氮细菌生物膜的形成，进而促进细菌在植物组织中定植，实现在有限氮的情况下谷物产量的增加，取得了非常显著的结果。该种方法或许也可以应用于抵御土传病害、促进根系中某类物质的吸收等其他方面。不过这种基因改造植株的后代表现不确定，是否容易发生基因重组导致改造的基因失效，或者其他基因的改造是否对该基因的表达产生影响，也需要后续证明。在解决了生物固氮的问题后，这种植株性状的延续性，和其他高产基因的兼容性有待商榷。 根际互作生物学研究室 简介 |
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