最新研究发现：这种方法可以促进脑内β淀粉样蛋白清除，并筛选出有潜力的药物

2022年7月21日，Scinece首页发表文章，打假2006年Nature期刊上发表的关于Aβ*56（一种56kDa的β淀粉样蛋白寡聚体）导致阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）患者记忆损害的文章，“β淀粉样蛋白”这一自诞生起便争议不断的理论似乎到了至暗时刻。

其实，关于Aβ是否导致AD的发生以及认知功能的减退一直存在争议，在关于Aβ的研究中Aβ*56也只是占一小部分，脑内Aβ的主要形式Aβ40和Aβ42（40和42为氨基酸数量）的研究更为广泛，且它们的毒性是十分确定的。

当前，Aβ可能是AD的“果”而非“因”，或者Aβ可能是AD某个阶段的“因”成为了很多人的共识，所以这次打假事件并不意味着关于Aβ的研究全都打了水漂，只是可能需要我们将Aβ与其它理论如Tau蛋白结合起来，揭开Aβ的真实面貌，焕发这一理论的新春，如新发现的δ-分泌酶在AD发病过程中发挥着至关重要的作用即是这样的一个过程。

针对Aβ相关药物开发的屡屡受阻。近日，华盛顿大学医学院的Joseph D. Dougherty团队在《Brain》上发表题为Aqp4 stop codon readthrough facilitates amyloid-βclearance from the brain的研究，发现当AQP4发生终止密码子通读（stop codon readthrough）产生AQP4X增加时，后者会定位于大脑血管周围并促进脑内Aβ的清除，据此筛选出促进AQP4终止密码子通读的药物，可能为AD患者的治疗提供新的希望。

确定AQP4X为研究靶点

星形胶质细胞特异性水通道蛋白AQP4是脑淋巴系统的关键介质，可清除脑内的β淀粉样蛋白。Aqp4基因敲除小鼠清除Aβ的效率降低50%，且将这些小鼠与APP/PS1 AD模型小鼠交配会加重后者Aβ积累和记忆缺陷。因此，增强AQP4清除功能的药物可能会加速Aβ和其他大脑副产物的清除。

以往研究表明AD患者血管周围的AQP4含量会降低，而新发现Aqp4 mRNA翻译时可以发生一个不寻常的终止密码子读取事件，产生一个C端延长的变体AQP4X，它恰恰存在于血管周围，而AQP4X是否特异性介导淀粉样蛋白清除还不清楚。

AQP4X介导β淀粉样蛋白清除

利用CRISPR-Cas9技术，作者在Aqp4终止密码子的下游插入了两个额外的终止密码子，由此构建的Aqp4 ^No_X小鼠不能正常生成AQP4X，而AQP4的合成不受影响。

Western Blot显示Aqp4 ^No_X小鼠AQP4X显著减少，而AQP4无明显变化，免疫荧光显示AQP4X特异性表达在血管周围。

将突变体和APP/PS1阿尔兹海默症模型小鼠杂交，通过检测大脑间质液（ISF）中Aβ的含量，发现其后代脑内Aβ显著上升，使用γ-分泌酶抑制剂处理阻断Aβ继续生成后持续监测间质液中Aβ含量，发现AQP4X可介导β淀粉样蛋白清除。

构建双荧光素酶载体进行药物筛选

既然AQP4X已被证明介导β淀粉样蛋白清除，那有没有药物可以促进Aqp4翻译时终止密码子通读事件的增多，从而产生更多的AQP4X呢？

作者通过使用双荧光素酶载体，在Renilla (RL)和Firefly luciferases (FL)之间克隆了Aqp4，这样RL组成性表达，而FL只有在Aqp4终止密码子被核糖体通读时才会表达，通过检测FL/RL的数值就能够筛选出促进Aqp4通读的药物，实验中DMSO作为阴性对照，Geneticin作为已知的促进终止密码子通读的药物是为阳性对照。有25种药物处理后FL/RL升高，3种药物处理后FL/RL降低。

正交系统证实了两种化合物是真正的Aqp4通读调节剂

为了排除这些化合物影响正常翻译的可能，作者将终止密码子突变成为有义密码子。结果显示，上述25种使FL/RL升高的化合物此时FL/RL与DMSO组无差异，说明它们不影响正常翻译，而上述3种使FL/RL降低的化合物此时FL/RL仍降低，说明它们损伤了细胞内的正常翻译，将其剔除。作者又继续使用双荧光素酶系统确定了这些化合物的最小作用浓度。

接下来，为了排除这些化合物是通过直接调控荧光素酶活性而非终止密码子通读的可能性，作者基于荧光的方法开发了一个正交系统，其中红色荧光蛋白（TdTomato）/绿色荧光蛋白(GFP)相当于前述的FL/RL，使用化合物的最小作用浓度处理转染的细胞，实验证明只有两种化合物-磺胺喹恶啉（Sulphaquinoxaline）和芹菜素（apigenin）能够促进Aqp4通读。Dot Blot也验证了磺胺喹恶啉和芹菜素处理后AQP4X表达增加。

磺胺喹恶啉和芹菜素通过调控Aqp4通读促进Aβ的清除

将磺胺喹恶啉（Sulpha）和芹菜素（Apigenin）应用于AD模型小鼠，发现它们都能降低大脑间质液中Aβ的含量。为了证明药物是促进Aβ的清除而非抑制其产生，使用γ-分泌酶抑制剂处理阻断Aβ生成，结果表明两种药物均能促进Aβ的清除。

引入Aqp4 ^No_X与APP/PS1杂交小鼠，发现两种化合物不能提高Aβ的清除率，证明其清除作用依赖于AQP4X起作用。

文章通过巧妙的设计和严密的实验证明了AQP4X能够促进脑内Aβ的清除，并筛选出了磺胺喹恶啉和芹菜素作为十分有潜力的治疗药物，作者也展望了增强特定mRNA终止密码子通读能力是否可以促进其他与阿尔兹海默症相关的蛋白质(如Tau蛋白、突触核蛋白)的清除，为今后的阿尔兹海默症的综合治疗提供了新的思路和方向。

撰稿｜布布

编辑｜小耳朵