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做过蛋白质印迹实验的小伙伴们都知道，封闭试剂的选择取决于蛋白质印迹检测步骤中使用的二抗的种类。这期的主题是Jackson ImmunoResearch公司为大家讲解：如何选择合适的封闭试剂？以及孵化时间和洗涤。 一、Jackson公司选择合适的封闭试剂： 蛋白封闭剂 封闭溶液的蛋白质成分应与被检测的抗原和二抗的种类相容。 牛血清白蛋白 (BSA) 和脱脂奶粉通常用于封闭溶液，因为它们既便宜又容易获得。然而，它们并不总是合适的，并且可能是背景的原因。 当使用针对来自牛或相关物种（如羊驼、山羊、马或绵羊）的抗体的抗体时，应避免使用 BSA 和脱脂奶粉。在许多 BSA 制剂中发现低水平的牛免疫球蛋白 G (IgG)。 建议使用来自标记二抗宿主物种的正常血清作为最佳封闭剂，以避免任何不必要的相互作用。使用前应制备新鲜的血清工作溶液，通常在浸入膜之前在所选缓冲液中稀释至 5% w/v。 缓冲溶液 通常使用 pH 范围高于大多数抗体（pH 范围 7.5-8.5）的等电点 (pI) 的缓冲溶液，例如 Tris 缓冲盐水 (TBS) 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。如果磷酸化蛋白是印迹的焦点，则不推荐使用 PBS。 这是因为一抗可以与缓冲液中的磷酸盐以及靶蛋白结合。还应考虑缓冲液 pH 值对检测步骤中使用的报告酶（例如碱性磷酸酶）活性的影响。 非离子洗涤剂 非离子去污剂通常包含在蛋白质印迹中使用的缓冲液中。它们可以防止聚集，这本身会导致背景，但也可以绑定到可能导致非特定交互的任何站点。 Tween-20™（通常为 0.1%）通常用作缓冲添加剂。 二、Jackson公司孵化时间和洗涤 应确定实现最佳信噪比所需的最短可能阻塞持续时间。虽然在 4°C 下过夜封闭可能很有吸引力，但过度封闭孵育会导致聚集和细菌生长，这可能会导致背景或干扰可视化。 封闭过程可能需要通过改变组分及其浓度、时间和温度来进行优化，以获得最低的背景和最高的信噪比。 值得注意的是，在封闭后用不含其蛋白质成分的缓冲液清洗膜很重要，因为它可以改善一抗对抗原表位的访问。（表1）
注意：专有的阻塞解决方案 有几种预配制的封闭溶液可供使用，它们在市场上销售时适用于所有实验条件。情况可能并非总是如此，尽管它们可能足以满足一组条件。重要的是要考虑后续试剂的种类可能会排除使用通用封闭溶液，并且使用标记抗体种类的正常血清可能更可靠。 注意：用 BSA 或牛奶封闭 牛血清白蛋白 (BSA) 和奶粉可能含有牛 IgG。抗羊驼、抗牛、抗山羊、抗马和抗羊抗体会与牛 IgG 发生反应。使用 BSA 或奶粉进行封闭或稀释可能会显着增加背景和/或降低抗体滴度，应避免使用具有这些特异性的抗体；使用标记二抗宿主物种的正常血清 (5% v/v)。如果 BSA 被视为封闭剂，请使用不含 IgG 的试剂以降低背景电位。（表2）
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