  背景介绍 有文献报道，含有PR结构域16 (PRDM16)是一种调控脂肪和肌肉代谢的转录因子。PRDM16在脂肪分化中起到了“开关”的作用，可以调控参与转化白色脂肪-棕色脂肪组织、骨骼肌肌肉-棕色脂肪组织的多种靶基因的转录（如Ucp1、Cidea等）。这表明PRDM16是米色脂肪细胞生物发生的主要激活因子。 有趣的是，在衰老过程中，PRDM16蛋白的表达量下降，但其mRNA水平没有变化。相比之下，常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶 1(Euchromatic histone lysine methyltransferase 1, EHMT1)和PPARγ的高度表达或使用类泛素分子NEDD8活化酶的抑制剂MLN4924可以延缓这一现象，并进一步促进脂肪组织的产热。这说明PRDM16蛋白在其中可能受到了泛素蛋白酶体等蛋白降解途径的调控。然而，这一现象的机制目前仍不明确，其E3连接酶复合物也仍未确定。为了解决这一问题，Shingo Kajimura课题组进行了相关研究，其成果“Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization”近期发表在Nature上。该研究发现了一种PRDM16的E3连接酶复合物，以及PRDM16蛋白稳定性对米色脂肪产生的影响及相关机制。   敲黑板啦！ 研究结果 1 首先，作者探究了MLN4924对PRDM16蛋白积累的影响是由cullin-RING家族哪个成员负责的。通过将cullin-RING成员(CUL1-7)与PRDM16进行异位共表达，发现CUL2降低了PRDM16蛋白的表达，且不影响其mRNA水平(图1A和图S1E, F)。在脂肪细胞中过表达CUL2也观察到同样的结果(图1B和图S1G, H)。而在腹股沟白色脂肪组织(IngWAT)来源的前体脂肪细胞中使用shRNA沉默Cul2会导致内源性PRDM16蛋白上调，其mRNA水平也没有变化(图S1I, J)。此外，环己酰亚胺追踪实验表明（Cycloheximide chase assays, 环己酰亚胺是一种干扰蛋白质生物合成过程的细菌毒素，该毒素可以阻止总蛋白质合成，通过检测细胞内靶蛋白含量降低一半所用的时间，以探究目标靶蛋白的稳定性），Cul2缺失显著延长了PRDM16蛋白的半衰期(图1C和图S1K)，这与先前的研究结果相一致。 同时，通过沉默Cul2以稳定PRDM16蛋白来调节原代和永生化脂肪细胞的下游代谢级联反应，而不影响脂肪生成(图1D和图S2A-D)。例如，Cul2缺失显著增加了PRDM16靶基因(如Ucp1)的表达，在使用Forsklin（腺苷酸环化酶激活剂）处理时效果更加显著。RNA-Seq分析表明，Cul2缺失后，棕色/米色脂肪功能包括线粒体呼吸、脂肪酸氧化和支链氨基酸降解等过程上调 (图1D和图S2E-G)。并且，Cul2缺失显著抑制了促炎途径(细胞因子信号途径和I型干扰素信号途径)和促纤维化途径(细胞外基质组织)(图1D和图S2H, I)。这些结果表明PRDM16激活了棕色/米色脂肪基因程序以及线粒体支链氨基酸和脂肪酸氧化，同时抑制脂肪组织炎症和纤维化。重要的是，白色脂肪细胞中Cul2缺失显著增加了细胞总的和解偶联细胞呼吸（OCR）(图1E)。而在脂肪细胞中过表达CUL2则降低了UCP1和线粒体蛋白的表达以及棕色/米色脂肪基因表达，并伴随着细胞呼吸减少，但对脂肪生成没有影响 (图1F和图S3A-D)。 有文献指出，CUL2通过与VHL等多种底物受体相互作用，发挥其支架蛋白的作用。因此，作者便探究CUL2如何通过调节PRDM16来控制脂肪细胞产热。作者首先使用ShCul2沉默WT或Prdm16-KO小鼠的iWAT原代脂肪细胞中的Cul2后发现，WT组的耗氧率增加，Ucp1、Cidea和Cox8b的mRNA水平显著升高，而在KO组中并没有变化 (图1G和图S3E)。随后，在过表达PRDM16或WT组的iWAT脂肪细胞中敲除Cul2后发现，尽管PRDM16过表达激活了产热基因的转录水平，Cul2缺失仍进一步增强了PRDM16对这些基因的调控(图S3F)。接着，在PRDM16过表达的脂肪细胞中过表达Cul2，发现CUL2减弱了PRDM16对棕色/米色脂肪基因的调控作用(图S3G)。总的来说，作者发现CUL2可以下调PRDM16的稳定性，降低其对产热基因的调控作用。
图1 | CUL2调节PRDM16蛋白质的稳定性和米色脂肪生物合成
图S1 | PRDM16蛋白和mRNA水平的调节
图S3 | Cul2过表达抑制脂肪产热而不影响脂肪生成 拓展阅读 PRDM16主要通过与其他的转录因子结合促进棕色脂肪细胞的产生并抑制白色脂肪细胞的形成。该作用主要依赖于其与转录因子的相互作用：PRDM16通过其锌指结构域与C/EBPβ结合形成转录复合物，诱导其他转录因子（如：PPARγ、PGC-1α）的表达。随后，PRDM16再与PPARγ和PGC-1α共结合激活脂肪生成和产热相关基因的转录活性，驱动完整的棕色脂肪分化程序。此外，PRDM16还通过与组蛋白修饰酶EHMT1和CTBP1结合，在染色质中添加抑制性组蛋白标记，并促进具有肌肉分化抑制功能的miRNA miR-193b和miR-365，从而抑制白色脂肪选择性基因和肌肉选择性基因的表达。
参考文献： 拓展阅读 拟素化修饰(Neddylation)是一种调节蛋白活性或功能但不介导其被26S蛋白酶体降解的蛋白质翻译后可逆修饰。其特征为神经前体细胞表达的发育下调蛋白8 (Neural precursor cell expressed, developmentally down-Regulated 8, NEDD8，与泛素具有高度的相似性（80%）)代替泛素与目标靶蛋白的特异性共价结合，因此该修饰方式也被称之为类泛素化修饰。 拟素化修饰与泛素化修饰类似，主要通过E1-E3的三级级联反应进行分子连接。首先，成熟的NEDD8与E1活化酶NAE(NEDD8-activating enzyme, NEDD8激活酶E1)以ATP依赖的形式形成高能硫酯键，活化NEDD8。在这之后，活化的NEDD8通过转硫醇反应转移到NEDD8结合酶E2上，并在NEDD8连接酶E3的帮助下转移到底物上，与底物的Lys残基结合，完成拟素化修饰。 拟素化除了与泛素化的高度相似性外，还能够调节其进程。Cullin-RING连接酶 (Cullin-RING ligases, CRL，一种多亚基复合体，通常由骨架蛋白Cullin、RING-box蛋白、衔接蛋白和底物识别蛋白四个部分组成) 是最大的E3泛素连接酶家族，其通过促进各种关键底物的泛素化和降解从而调控细胞稳态。其中，Cullin蛋白是拟素化的最主要的底物。只有当Cullin蛋白被拟素化激活后，CRL才能够发挥活性，促进泛素化进程的启动。本文使用的MLN4924是一种E3连接酶NEDD8的抑制剂，可以通过抑制NEDD8的拟素化作用调控Cullin蛋白。 拟素化还具有其他功能。文献报道表明，拟素化修饰可以促进PPARγ、固醇调节原件结合蛋白SREBP1c、乙肝病毒X蛋白HBX等靶蛋白的稳定性和活性，防止其被泛素化途径降解。此外，拟素化还可以引起核糖体蛋白S14滞留在细胞核核仁中而不进入细胞质。而由原癌基因MDM2介导的p53的拟素化更是可以抑制其转录活性，从而促进肿瘤的生长。
参考文献： [1] Zhou Q et al. Mol Cancer. 2019 Apr 3;18(1):77. 2 接下来，作者探究了脂肪细胞中CUL2-RING E3连接酶调节全身能量代谢的作用。首先，作者构建了脂肪特异性Cul2基因敲除小鼠(Adipo-Cul2-KO)(图2A和图S4A-C)。 在30℃条件下，Adipo-Cul2-KO小鼠iWAT中棕色/米色脂肪基因的表达水平显著高于WT组(Cul2 Flox/Flox)(图2B)。当在8℃条件下，Adipo-Cul2-KO小鼠iWAT中的脂肪酸氧化和组织呼吸显著高于WT组(图2C和图S4D)，但在肩胛骨间棕色脂肪组织(iBAT)和腓肠肌中变化不明显。在冷暴露期间，Adipo-cul2-KO小鼠冷耐受能力更强(图S4E)，且在Adipo-Cul2-KO小鼠iWAT的脂肪细胞中含有多房脂滴(图S4F-J)。在HFD条件下，Adipo-Cul2-KO小鼠的iWAT中PRDM16和UCP1蛋白水平均高于WT组(图2D和图S4K)，iBAT中PRDM16蛋白的表达水平也高于WT组，但UCP1的表达没有差异。HFD喂养第3周，Adipo-Cul2-KO小鼠的全身能量消耗(VO2)显著高于WT组，此时两组的体重、摄食量和活动量没有差异(图2E和图S4L, M)。4周后，Adipo-Cul2-KO小鼠的体重显著低于WT组(图2F和图S5A, B)。14周后，与WT组相比，Adipo-Cul2-KO小鼠iBAT的脂滴更小，而产热基因表达没有变化(图S5C, D)。Adipo-Cul2-KO小鼠的葡萄糖耐量更高(图2G和图S5E)。值得注意的是，当体重无差异时(第3周)，Adipo-Cul2-KO小鼠的葡萄糖耐量更高，所以这种改善不仅仅是由于较低体重引起的(图S2和图S5F, G)。不仅如此，Adipo-Cul2-KO小鼠也表现出更高的胰岛素敏感性(图2H, I和图S5H, I)。 此外，HFD喂养3周后，与WT小鼠相比，Adipo-Cul2-KO小鼠的iWAT和eWAT的纤维化和炎症反应显著抑制(图S5J-M)，这与先前的研究一致，表明米色脂肪生物合成增强与脂肪组织炎症减少密切相关，而并非依赖于UCP1（小编注：原文这里是引用了实验室先前的CM文献，PRDM16转录复合物以非偶联蛋白 1 (UCP1) 非依赖性方式有效抑制脂肪组织纤维化和炎症，其机制为PRDM16和EHMT1结合，被GTF2IRD1募集到促纤维化的基因的启动子/增强子区域，抑制TGFβ(Transforming growth factor β)依赖性促纤维化基因的转录，同时分泌β-羟基丁酸促进米色脂肪细胞分化并且起到抑制其向肌纤维细胞分化的作用）。Adipo-Cul2-KO小鼠肝脏的脂滴和甘油三酯减少，而脂肪从头合成基因表达没有差异(图2J和图5N, O)，血清胆固醇和甘油三酯水平也显著低于对照组(图2K和图S5P)。这些结果表明，脂肪特异性敲除Cul2可以显著促进米色脂肪产热，改善代谢健康。
图S4 | 在chow diet下Adipo-Cul2-KO小鼠的代谢表型
图S5 | 在HFD下Adipo-Cul2-KO小鼠的代谢表型 3 CUL2通过与E2酶、细长蛋白B (ELOB)、细长蛋白C (ELOC)和底物特异性受体相互作用而起到支架蛋白的作用(图3A)。为了鉴定PRDM16蛋白的底物特异性受体(图S6A)，作者通过免疫纯化分离米色脂肪细胞中的CUL2复合物，并使用液相色谱结合串联质谱 (LC-MS/MS) 对其进行分析(图S6B)。接着，将蛋白质组学数据与已发表的HEK293T细胞和成肌细胞中CUL2相互作用蛋白数据集进行比对，并确定了12个潜在的和CUL2相互作用的底物受体(图3B)。随后，利用shRNA筛选来确定哪些底物受体调节Ucp1转录(图S6C)。其中，APPBP2缺失显著增加了成熟脂肪细胞中Ucp1的mRNA 水平(图3C)。并且在永生化或iWAT原代脂肪细胞中APPBP2缺失均导致棕色/米色脂肪基因表达升高而不影响脂肪生成(图S6D-G)。 APPBP2起初被认为是淀粉样前体蛋白结合蛋白，后续研究进一步发现APPBP2也存在于E3连接酶复合体中。然而APPBP2的生理/病理作用尚不清楚。因此，作者便探究CUL2-APPBP2是否催化PRDM16蛋白多泛素化。首先，在蛋白酶体抑制剂（MG132）存在的情况下，iWAT脂肪细胞中PRDM16与CUL2-APPBP2蛋白之间存在相互作用(图3D和图S6H)。APPBP2在ELOB和ELOC结合后与CUL2相互作用，而在APPBP2突变后(L13A)，因其缺乏与ELOB和ELOC28的结合界面，APPBP2则无法与CUL2相互作用(图S6I)。在体外研究中发现，APPBP2直接与PRDM16相互作用，即纯化的APPBP2与PRDM16蛋白的两个结构域(氨基酸1-223和881-1038)结合(图3E)。在纯化的E1泛素激活酶(UBE1)、E2泛素结合酶(UBE2D1、UBE2D3或UBE2R1)和泛素(图3F)的存在下，加入纯化的PRDM16和NEDD8修饰的CUL2-APPBP2-RBX1复合体(E3)后，PRDM16的多泛素化重新启动。这是CUL2-APPBP2复合体特异性反应，因为用CUL1或CUL5取代CUL2并不能启动PRDM16的多泛素化(图S7A)。利用MS和PRDM16蛋白质的点突变分析，作者确定了PRDM16的六个生物相关泛素化位点(Lys122、Lys321、Lys578、Lys778、Lys790和Lys832)(图3G和图S7B-D)。重要的是，这六个泛素化位点(K6R)的Lys-to-Arg替换消除了PRDM16蛋白质的泛素化，并显著延长了其半衰期(图3H和图S7E, F)。
 图S8 | APPBP2缺失促进PRDM16蛋白稳定性和米色脂肪细胞生物发生 4 APPBP2敲除通过PRDM16激活米色脂肪 上述结果证实了脂肪细胞特异性抑制APPBP2和CUL2促进米色脂肪生物合成的假设。接下来，作者构建了携带floxed Appbp2等位基因的小鼠，从中分离出iWAT的SVF。与Cul2敲除的结果一致，Appbp2敲除引起PRDM16蛋白水平上调和棕色/米色脂肪基因表达增加，在给予Forsklin处理时更为明显(图S8C, D)。Appbp2-KO脂肪细胞含有更多富含嵴的线粒体和线粒体编码基因表达增加(图4A和图S8E)。此外，在使用去甲肾上腺素处理后，分化成熟的Appbp2-KO脂肪细胞的总呼吸和解偶联呼吸水平显著高于对照组(图S8F)。 为了探究CUL2-APPBP2的底物特异性，作者设计了3个实验。首先，在加入MG132后，通过免疫纯化获得了米色脂肪细胞的APPBP2复合体，并利用基于LC-MS/MS的蛋白质组学，通过总肽数量分析确定了PRDM16是APPBP2复合体中含量最丰富的蛋白质，CUL2是第二丰富的蛋白质(图4B)。这些结果证实了PRDM16与CUL2-APPBP2在脂肪细胞中的优势相互作用。此外，其他几种蛋白质也与APPBP2共纯化，其中包括GTF2I、EHD2、Smad4和PRDM3等。但APPBP2敲除没有改变这些蛋白，总泛素化水平也没有变化，而在Appbp2-KO脂肪细胞中PRDM16蛋白的表达显著高于对照组(图S9A-C)。作者WT和Prdm16-KO小鼠脂肪细胞中沉默Appbp2后进行转录组学分析，对比后，确定了PRDM16和APPBP2之间的功能关系。分析发现， APPBP2缺失上调了72个已知在棕色/米色脂肪细胞中富集的基因的表达。其中，87.5%以PRDM16依赖性方式上调(图4C和图S9D)。不仅如此，成肌细胞-棕色脂肪的转换也依赖于PRDM16：内源性PRDM16缺失的C2C12成肌细胞中Appbp2沉默不足以诱导棕色脂肪细胞分化(图S9E)。最后，细胞呼吸结果显示，Appbp2沉默显著增加了总的和非偶联呼吸（OCR）(图4D)。总的来说，这些实验证明了通过去除APPBP2可以促进PRDM16的表达，从而促进细胞呼吸，激活产热基因表达。
5 先前研究表明CUL2-APPBP2是PRDM16的E3泛素连接酶。接下来，作者便探究PRDM16蛋白稳定性的调节机制。有文献报道常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶1(Euchromatic histone lysine methyltransferase 1, EHMT1)可以调节PRDM16蛋白质的稳定性和棕色/米色脂肪细胞的发育。同时，作者发现EHMT1以剂量依赖的方式在PRDM16的结合界面(氨基酸881-1038)取代复合体中的APPBP2(图5A和图S9F)。重要的是，EHMT1将APPBP2从PRDM16复合体中置换出来后，PRDM16蛋白的多泛素化程度显著降低(图5B)。衰老是影响PRDM16蛋白稳定性的另一个因素(图S1A, B)，研究发现小鼠iWAT中APPBP2和CUL2的表达在24周龄后增加，与PRDM16和UCP1蛋白表达随年龄下降的趋势密切相关(图5C)。在iBAT中，APPBP2和CUL2的表达在48周龄及以后增加(图S9G)，而在以上两种组织中，急性冷暴露均没有改变PRDM16和CUL2-APPBP2蛋白的表达(图S9H)。 人类遗传学证据表明，APPBP2可能在代谢健康中发挥作用。首先，来自19,292名参与者的FinnMetSeq外显子组测序数据（一项芬兰受试人群的遗传疾病检测计划，通过对外显子测序，并与64个临床相关数量性状进行对比的数据集）显示，APPBP2基因中的一个单一序列变异(dbSNP：rs34146848)，该变异导致APPBP2蛋白在脊椎动物中进化上保守的氨基酸残基处发生Ser561到ASN突变(图S10A)。由于单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性)在非洲血统的个体中相对常见，因此作者又研究了来自英国生物库的一个非洲人队列(n=7,447)中APPBP2基因的遗传关联性。分析表明，尽管没有发现与该突变有显著关联，但APPBP2基因与调整了体重指数的腰臀比相关(dbSNP：rs8074975)(图S10B)。此外，APPBP2(S561N)与餐后2小时血糖和胰岛素水平降低有显著关联(图S10C, D)，因此可以猜测APPBP2(S561N)对PRDM16蛋白稳定性也会产生影响。通过实验发现，APPBP2(S561N)与PRDM16蛋白的相互作用弱于WT组，并且对PRDM16蛋白的多泛素化活性大幅降低(图S11A, B)。鉴于这种特性，作者通过CRISPR-Cas9技术在小鼠APPBP2的S561N和S562T（小编注：作者在文中提到，APPBP2的氨基酸序列的Ser561附近位点较为保守，仅在562号位置则出现了差异（即人源该位点为T而鼠源为S）。因此，作者为了概括确认APPBP2的人类S561N变体，在S561N和S562T两处引入突变从而模拟S561N的突变。）引入突变来产生Appbp2KI/KI小鼠，该小鼠携带人APPBP2的S561N变体(图S10A和S11C, D)。与WT细胞相比，Appbp2KI/KI鼠的分化后原代iWAT细胞棕色/米色脂肪基因表达水平更高(图S11E)。 基于此，作者进一步探究了脂肪特异性Appbp2-KO小鼠(以下简称Adipo-Appbp2-KO)的代谢表型(图S12A)。与对照组相比，Adipo-Appbp2-KO小鼠的iWAT和iBAT中PRDM16表达水平显著升高(图S12B)。在NCD、30℃条件下，进行CL-316,243处理后，Adipo-Appbp2-KO小鼠的VO2显著高于对照组(图5D和图S12C)，呼吸交换率(VCO2/VO2)则低于对照组，同时两组间摄食量和活动量没有差异(图S12D-F)。值得注意的是，Adipo-Appbp2-KO小鼠的iWAT含有多房脂肪细胞，且OCR增强和产热基因表达升高(图5E和图S12G, H)。相比之下，Adipo-Appbp2-KO小鼠的iBAT和eWAT无显著差异(图S12H-K)。当小鼠从30℃转为冷暴露（8℃）时，Adipo-Appbp2-KO小鼠显示出比对照组略高的冷耐受能力(图S12L)。 接下来，作者分析了在性别、年龄、饮食和外界温度等条件一致的HFD条件下，Adipo-Appbp2-KO小鼠的代谢表型。发现与Adipo-Cul2-KO小鼠类似，HFD 喂养4周后，Adipo-Appbp2-KO小鼠脂肪组织质量更低(图5F和图S12M)，体重显著低于对照组。12周时，Adipo-Appbp2-KO小鼠的iWAT质量显著低于WT组，而Ucp1、Cidea和Dio2的表达水平高于WT组 (图S13A, B)。与Adipo-Cul2-KO小鼠的情况一致，Adipo-Appbp2-KO小鼠的iBAT脂滴显著少于对照组(图S13C)，iBAT和iWAT中的脂肪酸氧化显著高于对照组(图S13D)。 HFD喂养 9-10周后，Adipo-Appbp2-KO小鼠的葡萄糖耐量改善和胰岛素敏感性增加(图5G, H和图S13E, F)，在HFD早期（体重还未出现差异）也观察到同样的现象(图S13G-L)。此外，在HFD喂养4周后，Adipo-Appbp2-KO小鼠的iWAT中促炎基因的表达水平显著低于对照组 (图S13M-O)。与对照组相比，Adipo-Appbp2-KO小鼠肝脏中脂肪生成基因并无差异，但肝脏TG、血清TC和TG含量更低(图S13P-R)。这些结果表明，脂肪组织中缺乏CUL2-APPBP2可以预防饮食诱导的肥胖、糖耐量异常、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性和血脂异常。 图5 | APPBP2控制全身能量代谢
图S11 | 人APPBP2 S561N突变体的功能表征 图S12 | Adipo- Appbp2-KO小鼠的代谢表型 图S13 | 在HFD下Adipo-Appbp2-KO小鼠的代谢特征 总结 本研究发现，CUL2-APPBP2泛素E3连接酶复合体可以催化PRDM16蛋白质的多泛素化和降解。这一现象随着年龄的增长而增加，从而引起细胞产热的下调。而抑制CUL2-APPBP2延长了PRDM16蛋白的半衰期，导致细胞自主激活产热基因以及抑制脂肪细胞中的促炎和纤维化基因，改善葡萄糖耐量、胰岛素抵抗和血脂状况。此外，EHMT1通过与APPBP2竞争直接与PRDM16结合，阻止其多泛素化来稳定PRDM16蛋白。总的来说，PRDM16蛋白稳定性所带来的代谢健康改善很可能超出了UCP1介导的产热和体重减轻，在肥胖治疗中具有重要意义。 |
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