|
2022年8月19日 理化学研究所 理化学研究所(理研)生命功能科学研究中心转录调控结构生物学研究小组的江原晴彦研究员、关根俊一组长、东京大学定量生命科学研究所染色质结构功能研究领域的鲸井智也助教、核桃坂仁志教授等共同研究小组，负责真核细胞基因表达的RNA聚合酶ⅱ( rnapⅱ) 阐明了在转录信使RNA(mRNA ) [2]时，通过在转录后立即重组刚刚存在的核小体[3]，在不破坏染色质[3]结构的情况下进行转录[1]的结构。 本研究成果将解答在真核细胞的核内基因表达和染色质结构的维持是如何并存的生物学上的巨大谜团，今后，转录调控及其破裂引起的疾病机制的理解有望发展。 真核生物的DNA与组蛋白[3]结合形成核小体结构，多个核小体连成一串，呈称为染色质的高级结构，被收纳在细胞核内。 RNAPII是负责转录mRNA的酶，转录DNA时需要解开核小体，但解开的核小体结构重新形成的机制尚不清楚。 此次，联合研究小组利用“低温电子显微镜[4]”，捕捉了RNAPII在多种蛋白质(转录延伸因子[5]和组蛋白伴侣[6] )的帮助下通过核小体的情况。 结果，RNAPII将前方的核小体暂时解体，在后方重新组装的结构首次明确了。 本研究刊登在科学杂志《Science》在线版( 8月18日:日本时间8月19日)上。 捕捉通过核酸酶前后的转录延伸因子复合体的结构 背景 在包括我们人类在内的真核生物的细胞中，作为生命设计图的基因组DNA采用被称为“染色质”的结构，紧凑地收纳在细胞核中。 染色质是DNA和蛋白质的复合体，在八个组蛋白蛋白质(组蛋白8聚体)的周围，DNA大约缠绕了两次，形成了像缠绕一样形状的“核小体”连成一串的结构。 染色质结构不仅在物理上保护基因组DNA，还承担着指定DNA的哪个部分在什么时候读出( =转录)的重要功能。 进行DNA转录的是一种叫做RNA聚合酶的蛋白质(酶)。 转录时，RNA聚合酶需要分解其通道上的核小体，一边解开DNA一边前进，可以说转录是破坏染色质结构的作用。 但是在实际的细胞内，RNA聚合酶在保持染色质结构的情况下进行DNA的转录，真核细胞是如何解决这个矛盾的，是生物学中多年来的谜。 本研究利用低温电子显微镜，像陀螺一样捕捉负责转录蛋白质设计图信使RNA(mRNA )的RNA聚合酶II(RNAPII )通过核酸酶时的结构，从而挑战了谜题的解开。 研究方法和成果
到目前为止，共同研究小组开发出了在RNAPII上转录核酸酶，使用低温电子显微镜分析其中形成的复合体结构的方法，明确了RNAPII阶段性地从组蛋白上剥离DNA的同时进行的情况(注1~3 )。 在此次研究中，我们以RNAPII通过核酸酶DNA的中部( dyad )时核酸酶会经历怎样的命运为焦点，进行了以下实验。
首先，设计了核苷酸DNA，使RNAPII开始转录核苷酸上的DNA，然后在4个位置停止。 在该设计中，通过在从RNAPII进入核苷酸序列的入口数第42、49、58、115个碱基对( bp )的位置停止转录，RNAPII的前端分别在dyad之前( 42bp )、dyad附近( 49bp ) 在这些核苷酸和RNAPII，以及细胞内转录所需的转录延伸因子和组蛋白伴侣FACT[6]的存在下进行转录，通过低温电镜分析了形成的复合体的结构。 结果得到了6种终止于DNA上4个位置的复合体的结构(图1 )。
在这些结构中，RNAPII结合转录延伸因子形成了巨大的转录延伸复合体( EC )。 这是第一次对结合了所有主要转录延伸因子的转录延伸复合体进行结构分析。 转录延伸因子几乎复盖了RNAPII的整个面，加强了DNA的入口和出口，重建了DNA通过RNAPII内的“隧道”结构。 图1通过核酸酶的RNA聚合酶与转录延伸因子复合物
然后，将得到的复合体的结构按照转录进行的顺序排列，成功地获得了转录延伸复合体通过核酸酶时的快照。 这一系列的快照是转录/延伸复合体侵入位于其下游(接下来要转录的DNA )的核酸酶，将DNA从组蛋白逐渐解开，我们明确捕捉到了通过dyad时使组蛋白转移到上游(转录完毕的DNA )，在DNA出口部分重新形成核小体的情况(图2 )。由此可见，RNAPII的转录-延伸复合体具有这样的机制，即在转录前进方向(下游)的DNA时，将分解过的核小体在转录后迅速在RNAPII的背后(上游)再生。 特别是在DNA出口周围，发现转录延伸因子形成了核酸酶的“摇篮”，支撑着逐步核酸酶再形成的过程(图2①、⑦)。  图2转录延伸过程中，将下游的核小体暂时解体，使其在上游再生的结构 ①核小体DNA转录开始前的状态。 ②随着转录-延伸复合体( EC )的推进，DNA从组蛋白表面被剥离。 H2A-H2B曝光后，组蛋白伴侣FACT利用尾部开始访问组蛋白( EC42 )。 ③EC到达核小体中央部( dyad )附近时，FACT与DNA剥离的组蛋白牢固结合( EC49 )。 ④保持在④FACT中的组蛋白从DNA中分离并向上游转移。 认为FACT的主体牢牢抓住了组蛋白六聚体( H2A-H2B-(H3-H4 )2)的部分，剩下的H2A-H2B被连接在FACT的尾部。 ⑤保持在⑤FACT上的组蛋白六聚体( H2A-H2B-(H3-H4 )2)在DNA出口附近与DNA结合( EC58hex )，核小体开始重绕。 ⑥加入剩余的组蛋白二聚体( H2A-H2B )，完成组蛋白八聚体( ( H2A-H2B )2-(H3-H4 )2) ( EC58oct )。 ⑦最后，随着EC的推进，大部分组蛋白8聚体被DNA覆盖，几乎完全的核小体得以再生( EC115 )。 在DNA出口周围，转录延伸因子通过与核小体相互作用，发挥着支撑阶段性核小体再形成过程的“摇篮”的作用。 如上所述，RNAPII通过核酸酶时，会发生组蛋白从下游到上游的传递，从而使RNAPII可以像没事一样通过核酸酶并继续转录(图3 )。 此次发现表明转录前后相同的组蛋白参与核小体的形成，明确了在维持染色质结构和组蛋白修饰等表观遗传信息[7]的同时进行转录的机制。  图3本研究总结 转录延伸因子复合体( EC )在通过核酸酶时，先解开核酸酶，再将组蛋白从下游传递到上游。 由此，转录完成后立即重新形成核小体。 注1 ) 2019年2月8日新闻发布会“顺利转录紧凑型DNA的机制” 注2 ) 2018年10月5日新闻发布会《阐明真核生物的基因读取机制》 注3 ) 2017年8月4日新闻发布会《阐明转录中RNA聚合酶ⅱ的结构》 今后的期待 染色质结构包含细胞表达特定基因集的信息(表观信息)，为了持续转录相同的基因，转录前后必须保留染色质的基本结构核小体。 本研究首次明确了RNAPII在其他多种因子的帮助下，将前方的核小体暂时解体，在其背后进行重组。 这被认为是避免转录对染色质结构影响的机制，但另一方面，已知转录有时会影响染色质结构。 在细胞内，进行表观信息改写的重塑因子[8]和组蛋白修饰酶[9]等与此次分析中使用的转录延伸因子和组蛋白伴侣一起协同工作，控制着染色质结构。 此次明确的通过核酸酶的转录延伸复合体的结构，有可能成为这些染色质调控因子作用的靶结构，有望成为今后表观遗传学[7]和转录调控研究飞跃的重要基础。 另外，已知组蛋白伴侣FACT在本研究中已明确转录延伸中的作用，不仅与RNA的转录有关，还与DNA的复制、修复、重组等有关。 这次的观察结果有可能与伴随着从核小体中解开DNA的反应的核内功能的普遍理解有关。 反映细胞内状态的巨大复合体，如转录核小体的转录延伸复合体，结构分析非常困难，是至今为止遗留下来的制药对象之一。 根据本研究得到的知识，今后关于转录调控和染色质结构破裂导致的疾病和衰老机制的研究有望发展。 补充说明
1.RNA聚合酶ⅱ( rnapⅱ)、转录
以DNA序列为模板合成RNA称为转录，细胞内通过DNA依赖性RNA聚合酶( RNA聚合酶)进行。 真核生物具有三种RNA聚合酶，RNA聚合酶ⅱ( rnapⅱ)负责mRNA的合成。 是由多个蛋白质(亚单位)聚集而成的巨大复合体，形状像从细菌到人类共同的“螃蟹钳”。 将DNA夹入中央形成的沟中，解开约10个碱基对的DNA形成“转录泡”，以一条链为模板合成mRNA前体。
2 .信使RNA(mRNA )
具有细胞合成的蛋白质氨基酸排列方式信息(密码子)的RNA。 在真核生物中，通过清除刚从DNA转录的mRNA前体中不含蛋白质信息的序列(内含子)，生成成熟的mRNA。
3 .核小体、染色质和组蛋白
通过缠绕DNA，将长大的DNA收纳在核内的蛋白质称为组蛋白。 存在H2A、H2B、H3、H444种核心组蛋白，两者聚集在一起形成组蛋白8聚体。 DNA缠绕在组蛋白八聚体周围的结构称为核小体，真核生物中以核小体为基本单位的基因组DNA和蛋白质的高级复合体称为染色质。
4 .低温电镜
为观察蛋白质等生物试样而开发的电子显微镜。 将含有蛋白质等试样的溶液薄薄地展开，在液体乙烷(-183~-160℃)中急速冻结，将试样封闭在极薄的冰层中，然后在液氮温度(-196℃)下用电子显微镜进行观察。 具有可以在生理性(接近细胞状态)条件下观察蛋白质试样，由于低温，电子束对试样的损伤减轻的优点。 这是近年来取得了长足发展的结构分析技术，也成为了2017年诺贝尔化学奖的对象。 本研究使用理化学研究所(横滨地区)和东京大学(定量生命科学研究所)设置的低温电子显微镜进行了分析。
5 .转录延伸因子
与RNA聚合酶结合，控制转录延伸反应的蛋白质。 本研究中，使用了所有主要的转录延伸因子Spn1、Spt6、Spt4/5、Elf1、Paf1C、TFIIS进行了结构分析。
6 .组蛋白伴侣，FACT
伴侣是具有辅助新生蛋白质取得正常立体结构，识别变性蛋白质并恢复正常结构或去除功能的因子的总称。 组蛋白伴侣蛋白，尤指与组蛋白和DNA结合或解离相关的因子。 本研究使用构成组蛋白伴侣FACT的Spt16和Pob3进行了结构分析。 FACT是facilitates chromatin transcription的缩写。
7 .表观遗传学信息，表观遗传学
不依赖于DNA碱基序列的基因调节机制称为表观遗传学。 表观遗传学的基本分子基础是DNA的甲基化和组蛋白的甲基化/乙酰化等基因特定领域被可逆地标记的“标记”，这种甲基化和乙酰化的信息被称为表观信息。
8 .建模因子
引起染色质结构变化的因子的总称。 与表观遗传学调控相关的因素之一。
9 .组蛋白修饰酶
催化组蛋白化学修饰的酶的总称。 包括负责可逆乙酰化修饰的乙酰转移酶和脱乙酰酶、负责可逆甲基化修饰的甲基转移酶和脱甲基化酶等。 联合研究组 理化研究所生命功能科学研究中心 转录调控结构生物学研究小组 团队领导关根俊一 研究员江原晴彦 蛋白质功能结构研究小组 领队白水美香子 东京大学定量生命科学研究所染色质结构功能研究领域 教授核桃坂仁志 助教鲸井智也 研究支援 本研究由理化学研究所运营费补助金(生命功能科学研究)实施，日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业基础研究( b )“与转录共轭的核小体重构的分子机制的阐明(研究代表者:江原晴彦)”、 同基础研究( s )“结合转录和核心生命功能的高次复合体的结构基础(研究代表者:关根俊一)”，同基础研究( a )“与染色质上发生的转录共轭的双链断裂修复的分子机制的阐明(研究代表者:胡桃坂仁志)”， 该新学术领域研究(研究领域提案型)“通过解析核小体高级结构和动力学揭示染色质潜能(研究代表者:胡桃坂仁志)”、科技振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业( ERATO )“胡桃坂染色质图谱”项目(研究总结 日本医疗研究开发机构( AMED )创药等生命科学研究支援基础事业创药等尖端技术支援基础平台( BINDS )“面向综合结构分析的高难度复合体的生产支援和高度化(代表者:白水美香子)”“用于表观遗传研究和创药的重构染色质的生产和性状分析( BINDS ) 生命科学创药研究支援基础事业( BINDS )“表观遗传学的基础原理阐明和为创药的组蛋白及重构染色质的生产(代表者:胡桃坂仁志)”，以及公益财团法人住友财团基础科学研究资助的“基于建模因子SMARCAD1的染色质结构转换和转录激活机制的阐明(资助对象:鲸井智也)”的支持下。 原论文信息
発表者 理化学研究所 生命機能科学研究センター 転写制御構造生物学研究チーム チームリーダー 関根 俊一 研究員 江原 晴彦 東京大学 定量生命科学研究所 クロマチン構造機能研究分野 教授 胡桃坂 仁志 助教 鯨井 智也 新闻发言人 理化研究所宣传室新闻发言人 东京大学定量生命科学研究所总务小组 email:soumu [ at ] iqb.u-Tokyo.AC.jp ※请将※[at]替换为@。 |
|
|
