【科研进展】肿瘤衰老分子影像

千百年来，探索衰老的奥秘、延缓和对抗衰老一直是人们最关心的研究主题，也是科学家们面临的巨大挑战。细胞衰老(Cellular Senescence)作为预防和治疗多种年龄相关疾病、延长健康寿命的潜在靶点，已经受到了极大的关注，逐渐成为近年来的研究热点。以往认为，肿瘤细胞的衰老可以抑制肿瘤进展，然而越来越多的研究发现，细胞衰老也能促进肿瘤的发生发展

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什么是细胞衰老？

细胞衰老是一种由应激性损伤和某些生理过程引发的细胞状态，具有稳定的细胞周期停滞、大分子损伤、代谢改变和衰老相关分泌表型(SASP)等特征。细胞的衰老贯穿生命的全过程，在胚胎发生、伤口愈合、宿主免疫和肿瘤抑制等多种生理和病理过程中发挥着重要作用，但随着年龄的增长和衰老细胞的不断积累，细胞衰老也会产生如肺纤维化、动脉粥样硬化等不良后果。

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细胞衰老在肿瘤中的双重作用

多篇发表于《Nature》、《Cell》的文章表明，细胞衰老是一把“双刃剑”，它可以抑制肿瘤进展，但同时也可能会促进肿瘤生长【1-4】。一般情况下，致癌基因异常激活，正常细胞进入细胞衰老，即细胞周期停滞状态，是防止肿瘤发生发展的一个重要屏障。然而，衰老的细胞通过分泌SASP，引起慢性炎症进而导致癌症发生、进展、转移、治疗失败并增加复发风险，还可通过旁分泌招募未成熟的髓系细胞促进肿瘤的发生。

肿瘤经过化疗或放疗后可以诱导肿瘤细胞衰老，即治疗诱导衰老（TIS），也对肿瘤有促进和抑制的双重作用【5，6】。一方面，衰老可以阻止癌细胞生长，从而限制肿瘤进展，其机制主要与衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性增加、p53和p16通路激活等相关。另一方面，长期培养TIS细胞导致干细胞标记物表达增加，部分衰老细胞重新进入细胞周期，激活抗凋亡、休眠和复发机制而促进肿瘤进展。（具体机制见图1）

图1 衰老细胞在肿瘤中的促进作用和抑制作用（此图版权所有，请勿随意使用）。

核因子-κB(NF-κB)信号在治疗诱导的衰老肿瘤细胞中被激活，从而推动产生IL-1α、IL-6、IL-8、CCL2、基质金属蛋白酶(MMP)和其他衰老相关分泌表型因子(SASP)。a.抑制肿瘤：IL-6、IL-8和CCL2可以招募自然杀伤(NK)细胞和T细胞，有助于免疫监视。IL-6和IL-8还可以通过增加活性氧(ROS)的产生和持续的DNA损伤，以自分泌的方式加强细胞衰老。此外，白介素类因子(ILs)可通过旁分泌的方式将衰老扩散到周围的癌细胞，从而进一步抑制肿瘤的生长。b.促进肿瘤：IL-6既可以直接由衰老的癌细胞分泌，也可以由从细胞外基质(ECM)中释放出来，招募髓系来源的抑制细胞(MDSCs)，最终导致免疫抑制微环境。从ECM中释放的生长因子可促进肿瘤生长和上皮向间充质转化(EMT)，从而导致转移。SASP中的血管内皮生长因子(VEGF)刺激血管形成，也有助于转移。此外，一些SASP因子还可促进衰老的肿瘤细胞干细胞化，表现出干细胞特征，如干细胞标记物增多，进一步促进肿瘤进展。                                            

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衰老细胞的检测

因此，对于衰老细胞的检测显得尤为重要。目前，通过测定SA-β-gal来检测组织或机体中的衰老细胞是研究中使用最广泛的方法。SA-β-gal是一种糖苷水解酶，它作用于糖苷键催化β-半乳糖苷水解成单糖，是检测细胞衰老的重要靶点。利用此作用位点和机制，一些分子被研究出来用于检测β-gal。

其中，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）在pH 6.0条件下可被β-gal水解形成蓝色沉淀而聚集在细胞中使衰老细胞呈现蓝色，是目前在细胞或者离体组织水平检测衰老细胞的标准方法，已经在细胞生物学及病理学研究中广泛应用。

但是这种方法并不能应用于活细胞显像，所以一些β-gal荧光底物分子被研发出来进行细胞显像以观察细胞衰老的过程。而该类荧光探针因发光波长短，穿透性有限，无法用于动物显像。

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我们的工作

中南大学湘雅二医院马晓伟老师与合作者前期开发了一种β-gal靶向近红外荧光分子探针NIR-BG，成功的对动物活体进行了肿瘤细胞衰老显像（原理见图2）。在活体水平验证了宫颈癌、乳腺癌细胞经过化疗或放疗后，大部分肿瘤细胞凋亡的同时会有小部分细胞进入衰老状态【7】。

图2 使用NIR-BG探针进行细胞衰老的光学检测原理（图片引自文献7）。

   然而小分子荧光探针在体内的代谢动力学仍不够理想，被β-gal水解后很快被细胞清除，不利于长期观察肿瘤细胞衰老状态。于是又创新性的利用酶活性分子探针（Activity-based Probe，ABP）策略将二氟甲基引入β-gal荧光分子探针结构构建了新的活性基础近红外探针NIR-BG2，该探针可被β-gal剪切后以共价方式结合在蛋白酶上，从而更加持续的追踪蛋白酶的活性及其分布（原理见图3）。利用该探针成功的在细胞和动物模型中观察到化疗药物所诱导的肿瘤细胞衰老以及其耐药的过程，证实了该新型β-gal靶向ABP能够被β-gal识别并稳定结合于蛋白酶上，实现了更长时间观察细胞和组织衰老，在细胞和动物水平都取得了更佳的成像效果，进一步推动了衰老分子影像的研究【8】。

图3 近红外光学分子探针NIR-BG2检测原理（图片引自文献8）。

    在前期工作中，虽然实现了更好的酶活性可视化及活体动物近红外成像，但由于光信号的组织穿透性限制，仍无法在大动物水平实现成像研究，更无法向临床应用进行转化。而核素显像尤其是PET显像则能够有效的解决这一瓶颈，并且可以实现精准定量分析。因此，本课题组构建了首个β-gal靶向的PET分子探针⁶⁸Ga-NOTA-M-Gal-1，并进行了初步研究，发现该探针具有良好的稳定性，并且能够被β-gal特异性识别并活化，从而稳定结合在该蛋白上，以聚集在衰老细胞中。利用该探针进行PET显像观察衰老，已取得了一些有价值的结果。接下来我们将进一步优化探针结构并以多种方案进行放射性标记，构建更加完善的新型衰老多模态分子影像策略，从而从细胞、组织、人体水平对细胞衰老进行实时、动态、定量的监测。

          【中南大学湘雅二医院核医学科/PET影像中心】

参考文献：

1.     Faget, D. V., Ren, Q. & Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nat. Rev. Cancer 19, 439–453 (2019).

2.     Gorgoulis, V. et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell 179, 813–827 (2019).

3.     Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D. & d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 22, 75–95 (2021).

4.     Kang, T.-W. et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature 479, 547–551 (2011).

5.     Fitsiou, E., Soto-Gamez, A. & Demaria, M. Biological functions of therapy-induced senescence in cancer. Semin. Cancer Biol. 81, 5–13 (2022).

6.     Wang, L., Lankhorst, L. & Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nat. Rev. Cancer 22, 340–355 (2022).

7.     Wang, Y. et al. Real-time imaging of senescence in tumors with DNA damage. Sci. Rep. 9, 2102 (2019).

8.     Liu, J. et al. Noninvasive NIR Imaging of Senescence via In Situ Labeling. J. Med. Chem. 64, 17969–17978 (2021).

本文原创作者：中南大学湘雅二医院核医学科/PET影像中心【向馨，马晓伟】