Nature：二甲双胍通过PEN2激活溶酶体AMPK途径

新用户0641yy4L 2022-09-08 发布于河南

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二甲双胍是临床治疗2型糖尿病的首选药物，具有价格低廉、降糖效果好且副作用小等优势。近年来研究发现，除了降低血糖，二甲双胍在缓解脂肪肝、保护心血管、降低癌症发生风险及缓解神经退行性疾病症状等方面也展现出一定疗效。此外，对于健康人群，二甲双胍也表现出延缓衰老和延长寿命的作用。因而二甲双胍也被称为“神药”，它经常和卡路里限制一起，被列为人类未来通向健康长寿之路的重要手段之一。

然而，长久以来，二甲双胍发挥作用的直接分子靶点一直不清楚。二甲双胍作用于肝脏、肾脏和肠道等器官，在转运入细胞后，主要通过激活AMPK信号通路来发挥其降糖、降脂等重要生物学功能。AMPK是人体能量代谢稳态调节中枢，但是二甲双胍激活AMPK的分子机制一直不明确。

此前有研究表明，二甲双胍通过抑制线粒体电子传递链复合体I，从而提升AMP水平，通过经典的AMP依赖的方式激活AMPK来发挥功效。但相关实验使用的二甲双胍浓度远高于临床剂量，且均是体外实验，因此这一信号通路并不能解释临床用药获益的实际效应。

厦门大学生命科学学院林圣彩团队长期致力于代谢稳态和代谢疾病发生机制研究，提出二甲双胍对AMPK的激活可能是“另辟蹊径”的，其可能以一条全新的、不依赖于AMP的通路来激活AMPK。2016年，其团队在《Cell Metabolism》发文表明，二甲双胍可能通过他们先前发现的溶酶体途径激活AMPK，为二甲双胍的功效行使指明了粗略方向。2022年2月24日，林圣彩院士团队在《Nature》上发表了题为“Low-dose metformin targets the lysosome–AMPK pathway through PEN2”的研究论文，找到了二甲双胍的直接作用靶点PEN2（γ-secretase的亚基），并阐明了其通过与跨膜蛋白v-ATPase的ATP6AP1亚基结合，进而激活溶酶体AMPK通路发挥生物学效应的分子生物学机制。

1、临床剂量二甲双胍激活AMPK不通过经典AMP依赖途径

首先研究人员以人类服用临床剂量二甲双胍后，血浆及肝脏中二甲双胍的浓度校准获得小鼠及不同细胞中的处理条件，以模拟临床剂量二甲双胍的效应。作者发现临床剂量二甲双胍可以直接抑制小鼠原代肝细胞中v-ATPase的活力，激活AMPK，然而AMP/ATP和ADP/ATP比值未发生变化，即临床剂量二甲双胍在不改变细胞内能量水平的情况下激活AMPK。

2、二甲双胍结合PEN2激活AMPK

为了寻找和二甲双胍直接作用的分子，研究人员突破了多个化学合成的难题，合成了一种光活性二甲双胍化学探针（Met-P1），它可以像钓鱼一样，钓出能与二甲双胍结合的蛋白。通过这种方法，他们从细胞中“钓”到3042种可能和二甲双胍结合的蛋白；由于二甲双胍可以独立地通过溶酶体途径激活AMPK，作者通过查阅资料发现这3042种蛋白中有219种为溶酶体驻留蛋白，58种被报道和溶酶体有关的蛋白。此外，为了避免在质谱分析中由于蛋白低表达水平低或胰蛋白酶消化不良可能导致的遗漏，作者另增加90种已知溶酶体蛋白，共计选出367种蛋白进行下一步验证。作者在HEK293T细胞中逐一过表达这些蛋白，通过pulldown实验一一验证这些蛋白与Met-P1的相互作用，找到113种与二甲双胍结合的蛋白；通过慢病毒介导的shRNA将MEFs细胞中这113种蛋白逐一敲低，发现其中只有一个蛋白PEN2敲低后，临床剂量二甲双胍无法激活AMPK。作者进一步确认在小鼠原代肝细胞、MEFs细胞和HEK293T细胞中敲除PEN2会阻断临床剂量二甲双胍诱导的AMPK激活。综上所述，PEN2能够结合二甲双胍并介导临床剂量二甲双胍激活AMPK信号。

接着研究人员通过差示扫描量热法（DSC），等温量热法（ITC）, 表面等离子共振法（SPR）及肽指纹（PMF）等一系列物理化学实验证明二甲双胍结合在PEN2的F35和E40位点。同时pull down实验证实PEN2-2A（F35和E40）突变体不能与Met-P1结合，并且在PEN2^-/-MEFs细胞中回补PEN-2A突变体后，临床剂量二甲双胍无法激活AMPK。作者通过随机光学重建显微镜，共聚焦显微镜及透射电镜发现部分PEN2定位在溶酶体上；分别在PEN2^-/-MEFs的溶酶体、线粒体、内质网以及高尔基体中特异性表达PEN2，只有表达在溶酶体上的PEN2介导临床剂量二甲双胍激活AMPK。这些结果表明，溶酶体中的PEN2结合二甲双胍激活AMPK信号。

3、PEN2通过与ATP6AP1作用进而激活溶酶体AMPK

明确二甲双胍靶向PEN2后，作者进一步探索PEN2是如何参与溶酶体AMPK激活过程。研究人员使用免疫沉淀质谱联用（IP-MS）技术寻找PEN2相互作用蛋白，发现了ATP6AP1蛋白，这一蛋白是溶酶体AMPK信号通路中关键蛋白v-ATPase的亚基。作者在细胞和纯体外条件验证了PEN2与ATP6AP1之间的二甲双胍依赖性结合。作者进一步在HEK293T细胞中转入带有myc标签的不同ATP6AP1截短质粒，通过免疫沉淀技术寻找与PEN2结合的ATP6AP1特定区段，发现ATP6AP1跨膜结构域的420至440位氨基酸残基负责与PEN2结合。在ATP6AP1^-/-MEFs细胞中回补ATP6AP1^Δ420–440突变体后，临床剂量二甲双胍无法激活AMPK。此外通过软件模拟分析，作者发现PEN2有20个氨基酸残基负责和ATP6AP1结合，同时PEN2-20A突变体不与ATP6AP1发生二甲双胍依赖性结合。而在PEN2^-/-MEFs细胞中回补PEN2-20A无法介导临床剂量二甲双胍激活AMPK。综上所述，二甲双胍通过PEN2与ATP6AP1的结合作用进而激活溶酶体AMPK。

4、临床剂量二甲双胍发挥生物学作用依赖于PEN2和ATP6AP1的参与

阐明二甲双胍激活AMPK的分子机制后，研究人员进一步在模式生物中对二甲双胍的一系列效应进行分析。首先他们在小鼠肠道细胞中敲除PEN2（PEN2-IKO），口服糖耐量实验（OGTT）结果显示，在PEN2-IKO小鼠中二甲双胍的降糖效果显著减弱；在小鼠肝脏中敲除PEN2（PEN2-LKO），发现PEN2-LKO小鼠中二甲双胍对肝脏脂质堆积的改善作用大大降低，OGTT实验显示其降糖效果也受到影响；在秀丽隐杆线虫中敲低PEN2，生存曲线分析显示，在PEN2敲低组中二甲双胍不再具有延长寿命的作用。上述结果表明二甲双胍激活AMPK信号改善血糖、脂肪肝、延长寿命的生物学效应均依赖于PEN2。

此外，在小鼠肝脏中敲除ATP6AP1，并引入不与PEN2结合的△420-440突变体后，二甲双胍的降脂和降糖作用均明显降低；类似地，秀丽隐杆线虫中，其延寿作用消失。最后，研究人员利用小鼠饲料中添加0.1%二甲双胍以激活AMPK延长小鼠寿命、延缓衰老的小鼠模型，发现敲除肝脏PEN2或ATP6AP1并引入ATP6AP1^Δ420-440后，二甲双胍在敲除组的AMPK激活被显著抑制。这些结果表明二甲双胍发挥其生物学作用需要PEN2和ATP6AP1的参与。

总结：

该研究发现当临床低剂量的二甲双胍进入细胞内后，与溶酶体膜上PEN2结合，PEN2进一步与ATP6AP1相互作用，抑制v-ATPase的活力，从而激活溶酶体途径AMPK信号，发挥相应的生物学效应，如降糖，降脂及延长寿命等。本项工作是二甲双胍研究的里程碑式工作，阐明了二甲双胍的作用靶点和作用机制，为糖尿病等代谢性疾病的治疗，乃至抗肿瘤、抗衰老、延寿的药物研发和应用提供了崭新的思路和可靠的理论依据。