|
小灵子，我，即将毕业的医学研三狗，分享一下从师姐以及大神那里学来的提质粒方法，第一次做，算比较成功，虽然其中过程非常曲折。中间问了身边好多同学，都不是很会，研一上课的时候学实验，老师也只是简单讲了一下提纯的步骤，所以我这个科研小白还是打算来和大家分享一下，希望对有需要的同学有所帮助，也希望大家能够多多交流，万一有大神指点呢！ Day1 第一天最重要的是什么！当然是准备工作！ 准备工作 1. 配液体 LB（这个东西我们这么叫，但是同科室专门做菌的小姐姐管它叫脑心脊液，也是我比较困惑的一点）蛋白胨 10g， 酵母 7.5g， NaCl15g，去离子水定容到 1000ml —— actually，用不了那么多，两个样最多用 300ml，剩下的近期没有其他人用，扔掉我们还很心痛，所以暂时还放在我们 4℃ 冰箱里保存着呜呜呜——所以，如果没有那么多样品的话，建议可以按比例减掉的哟！ 2. 配 CaCl 2 ：4.44g CaCl 2 + 500ml 去离子水 （当然一次就用一点点，也可以按比例递减的）不过没用完，没结晶的话以后也可以用。 3. 配固体培养基：蛋白胨 1g ， 酵母 0.5g， NaCl 1g ， 琼脂1g，去离子水定容到 100ml。 4. 玻璃珠（这个是涂我们的小菌菌用的，我觉得用接种环、干净的棉签、小木棍都可以，实验室有啥用啥，能省就省！） 5. 一套枪头（作为科研狗就别问我一套枪头是什么意思了！） 6. 玻璃培养皿 (讲道理，塑料的10cm皿也可以)。 7. 离心管（ 15ml 的多来点！） 8. 一盒Ep管（ 1.5ml 的就够了） 9. 配抗生素： Ampicillin ：工作液 100μg/ml ,可以先配成 100μg/μl ,用时 1:1000 Kanamycin ：工作液 25μg/ml ,可以先配成 25μg/μl ,用时 1:1000（不一定每个质粒都一样哦，记得看它带来的说明书！！！） PS：固体培养基先不要高压，凉了就凝了！其他的速度高压，烘干放在超净台里等待我们接下来的实验hiahia~ 步骤一：摇菌 将大肠杆菌（一点就够~具体我反正是加了 10μl ）3~4ml LB 培养基中， 37℃ 过夜，剧烈摇晃~ 150-200r 就可以啦。SHAKE! JUST SHAKE! LET’S SHAKE!（我用的是大肠杆菌，其他菌种，作为一个菜鸟我也不是很清楚了！如果实在不知道就去多问一问吧、自己查去！哈哈哈哈哈） Day2:又是新的一天！ 步骤一：菌种活化 把我们昨天摇的菌拿出来，观察一下下它活没活——如果活了它会又臭又浑浊的~但是会很开心~小菌菌它活了~ 菌：LB=1:1000 （大神表示其实 1:100~1:300 比较好，能活化的快一点） 37℃，110r 剧烈摇， 1~1.5 小时 （可能 3h更好一些） 目的：让菌液的 OD 值在 0.3~0.6 之间，处于对数期。 步骤二：高压灭菌 高压灭菌，请根据自己实验室的情况在活化菌种的三个小时里，高压固体培养基。 高压完的固体 LB 冷却到手温—这个温度需要自己掌握，我第一次做的时候就翻车了，因为冷却到手温再加抗生素再倒就已经来不及了，前几个皿还算可以，剩下的直接给我凝在了锥形瓶里，所以第二次老师弟帮我问了度娘，说手心不烫手背烫的温度就可以了（当然这个有点迷幻我没做到） 后来我又问了实验室养菌的美丽小姐姐，她表示 50~60℃ 就可以，她加很多种抗生素，那些抗生素该好用还是会好用的，于是我做的时候就放心大胆地只要 温度降到在我手可以忍受的程度了，就开始加抗生素然后倒平皿！ 所以真正的实验步骤开始了：以下步骤请在超净台中完成。 高压后的固体培养基冷却到实验者自己可以忍受的温度，按质粒说明书上所带的抗生素浓度加入抗生素，倒入平皿中，打开排风扇，打开平皿盖等凝固，凝固后盖上平皿盖，倒置平皿。 PS：磨叽的我又来了！倒平皿的时候请把皿拿起来半盖盖子胳膊肘放在台子上，皿举在你的眼睛前面，这样能保证你的手不会污染皿，也能保证你能看到倒了多少培养基进去。像这样：
培养基的量就是不能太薄到一挑就破了，也不能太多，要不其他皿该不够了。 然后培养基倒完了不能有气泡，要平整—老师弟在我耳边这样念叨。 步骤三 取出摇好活化的菌，取 1~1.5ml 加入 Ep 管中， 4℃ ， 1000r ， 1min（这个我觉得取决于你要提几个质粒，样品多的话取两管 1.5ml 的）。 步骤四 用枪头吸出培养基，加入 200μl 预冷过的 4℃ CaCl2 ， 吹打混匀，分装 5 0μl 一管，制备感受态。 步骤五 把分装出的 EP 管在冰上静置 20min ，加入质粒 50~100ng （我觉得如果质粒浓度本身就高可以多加一点，毕竟少于1μl量太小不好掌握，别浪费就行），再冰上静置 20min ， 热激42℃，90s （务必精准迅速！），插回冰上，静置 10min 。 热激是为了打开孔道，让质粒进入，插回冰上是为了关闭孔道，让质粒出不来~hiahia~（这一步是很重要的一步，隐藏着很多细节，比如你什么时候制冰，什么时候开恒温水浴箱，原始的质粒什么时候找出来，我就提醒到这里啦，根据自己实验室情况看着办吧）。 步骤六 加入无抗生素 LB 每管 500μl ， 37℃ 慢摇（ 80r ）， 1h。 目的：转进去质粒的细菌表达出抗性蛋白，使细菌耐对应的抗生素。 步骤七 涂板，这时候就是要用到玻璃珠或者接种环balabala的，加入适量菌液（我怕菌不算太多，加了 80μl ，一般 50μl 就够，太多了菌落容易疯长不好挑菌），玻璃珠就轻轻来回摇就可以了，你能看到培养基上菌液划过的痕迹。接种环或者别的就自己想吧，反正涂开就行。 Like this ~
步骤八 倒置平板， 37℃ 孵箱过夜。 PS：今天的实验要设置好对照，需要有加抗生素培养基的空白对照，加了菌种的阴性对照，和你的样品。如果明天一看空白对照和阴性对照长了菌，恭喜你不用继续往下做了，要不就是污染了，要不就是抗生素不好使。如果明天你的样品没长出来菌，恭喜你也做不下去了，要不就是抗生素加多了，要不就是质粒没进去哈哈哈哈！(以上代表个人观点，如有不对请告诉我！) Day3:又是新的一天！ 步骤一 取出平皿，观察菌落是否生长， 4℃ 倒置放（先保存一会， 37℃ 时间久了菌落会太多） 步骤二 将抗生素按说明书浓度加入 LB 培养基中，培养基 3~4ml ，挑出菌落，连枪头一起打入（注意是单个菌落，我问了一个可爱的老师什么叫单个菌落，我们一致认为就是长得小的哈哈哈） 为了以防万一，第一次做这个实验的我选择挑了两个看着顺眼的小菌落~ 步骤三 37℃ ，剧烈摇 150r 过夜。 PS：挑菌的时候用枪头，尽量不要扎破培养基，并且挑一半留一半，我觉得轻轻刮下来就好，毕竟只是为了把小菌菌挑出来继续长。这步时间很少，找空隙做就好，晚上离开实验室之前给它摇上就行，因为菌摇的时间不宜太长， 15~17h 比较好，太久的话菌会老化也会变得太多。 前面忘记说了，因为大肠杆菌的特性，这种离心管摇的时候要拧松但是拔不下来。然后摇的时候离心管斜着插，保证能摇起来。 大概图中介个亚子：
Day4：又又又是新的一天！ 今天我们就要用到 21 世纪科研工作者的福音：试剂盒，今天需要先小提一下先验证一下扩增的质粒是否和原质粒一致，第二天再进行质粒大提。 质粒小提不要把菌液都用了，否则大提就没有菌啦！4ml我就用 1.5ml ，一个 EP 管的量就可以啦。 步骤一： 质粒小提 质粒小提：下面附上说明书（我和老师弟一致认为这玩意太好用了）。 PS:小提的时候就不用在超净台里面啦!只要按照说明书操作就可以啦，注意试剂顺序不要加反什么的。离心时间和加入液体的体积按自己菌液的情况加入，我，身为一个天秤，在保证实验能进行下去的情况下都取了比较中间的值~
质粒小提的这个试剂盒不是去内毒素的，价格很便宜，毕竟只是为了初步验证质粒质量，如何验证呢？蛋白用 WB ，核酸当然用琼脂糖 ~ 步骤二： 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳：自己好好查一下配 LB 培养基的琼脂和琼脂糖！试剂上多数都是英语，用翻译软件的时候一定要看清楚不要弄反了，琼脂糖好贵的呢！ a)制备琼脂糖凝胶：
b)点样：上样前预电泳3~5 min 。核酸样品与上样缓冲液混合后，点样，先加入 Marker 。6×loading的话就可以：1μlloading ， 3μl去离子水， 2μl核酸样品（感觉这个实验整个就很随意，根据自己条件调节吧）。 c)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压 60-100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm处时，停止电泳。 d)电泳后的凝胶照相：将染色后的凝胶置于紫外灯下进行照相。摄影用的紫外模式。选择合适曝光时间，一般为5 秒左右。 大致分子量位置相同则你的质粒就是成功的啦，拿 Day3 所得菌液剩下的继续摇菌，等着明天大提就可以啦~ 这里要说一下我又问的傻乎乎的问题，大提我就是用小提 剩下的菌+100ml 加抗生素 LB ， 150r 剧烈摇，过夜 。为了空间够我用的是锥形瓶，然后把盖子弄松以后打开机器开始 shake，盖子，居然，飞了出去！还好我眼疾手快扶住了！急忙问了大神，大神表示，你们那个锥形瓶盖子是透气的吧。 我……感觉自己是个 simpleton！神奇的透气盖子如图
Day5：质粒大提
以上就是我做质粒扩增及提纯的全部经验啦，啰啰嗦嗦说了一大堆，在这里感谢，在这一个简单实验期间为我提供各种支持的老师们和小伙伴们~
|
|
|
来自： Amazing427 > 《质粒构建》
