|
α-地中海贫血(α-地贫)是严重威胁人类健康的一种致死、致残的遗传性血液病，作为在中国携带率最高的轻型α-地贫基因型--SEA/αα，针对该类携带者人群的ζ-珠蛋白精确定量，是阐明α-地贫患者表型变异性的重要基础。南方医科大学徐湘民教授课题组利用自研的ELISA试剂盒，首次实现了基于ELISA方法的东南亚型缺失(--SEA)携带者中ζ-珠蛋白精准定量。同时，华大基因自主开发的基于血红蛋白亚基质谱定量检测的地贫携带者鉴别策略，作为非抗体方法被引入开展独立性验证。验证结果表明，该ELISA方法及质谱方法均可开展传统HPLC未能实现的(--SEA)携带者中ζ-珠蛋白高灵敏度检测。相关研究成果发表于国际知名期刊《临床病理学杂志》(Journal of Clinical Pathology，IF=4.463)上。 研究背景 1.1 东南亚型缺失(--SEA)携带者及其表型变异性 α-地贫是由于基因突变使α-珠蛋白肽链合成减少或丧失而导致的遗传性溶血性贫血。东南亚型缺失(--SEA)携带者个体仅携带2个功能正常的α-珠蛋白基因，血液学检查结果会呈现典型的小细胞低色素现象(MCV< 80 fL和MCH<27 pg)，但这类人群往往无明显临床表型并不需要输血治疗。 1.2 为何要开展ζ-珠蛋白肽链定量研究 ζ-珠蛋白属胚胎期表达的珠蛋白，于人体胚胎发育早期在卵黄囊以及肝脏中表达，正常情况下妊娠2个月后该蛋白停止表达，并逐渐转换为开启α-珠蛋白表达。然而在(--SEA)携带者体内，ζ-珠蛋白却持续表达至终身，这可能是缓解患者表型的一个重要因素。因此，探索α-地贫携带者和患者的ζ-珠蛋白定量方法，研究胚胎期特异的ζ-珠蛋白再激活机制，或可成为探索α-地贫基因治疗的有效策略。 研究方法 本研究首先从Hb Bart’s胎儿脐带血溶血中分离纯化ζ-珠蛋白单体，采用自建的ELISA系统进行蛋白绝对定量，并以此作为后续研究的蛋白标准品。之后，对6179个个体(已通过PCR基因分型确定的6079个--SEA/αα基因携带者及100个正常对照)的外周血样本进行大规模ELISA定量分析。最终，利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)手段测量独立实验组141个--SEA/αα携带者中ζ-珠蛋白的表达，作为该自建定量系统的一种独立验证手段。  详见原文图1. 本研究工作流程 研究结果 3.1 纯化ζ-珠蛋白的验证及标准定量 本研究利用自主研发的ζ-珠蛋白单克隆抗体(mAb)4D11制备了ζ-珠蛋白单克隆抗体亲和层析柱，偶联抗体率为96.7%。通过亲和层析法测定Hb Bart’s胎儿脐带血中的ζ-珠蛋白，根据A280nm处目标蛋白信号确定回收组分，如图2A。亲和层析后，利用SDS-PAGE进行纯化和MW验证，同时利用anti-ζ和anti-γ抗体进行Western Blot成分分析，发现溶血提取物中，ζ-珠蛋白以ζ-、γ-珠蛋白二聚体及ζ-珠蛋白单体两种形式存在，分子量分别为32Kda和16Kda，如图2B。纯化后的蛋白只有ζ-珠蛋白单体一种形式，可利用研究团队之前开发的ELISA试剂盒进行有效检测，如图2D。  详见原文图2. 纯化ζ-珠蛋白的验证 用PBS对纯化后的ζ-珠蛋白进行20倍稀释，以15 μg/mL和30 μg/mL蛋白标品(36.3 g/L，Roche)为control组，用Pierce微量蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行两组平行测定。ζ-珠蛋白定量平均值13.185 μg/mL，原浓度263.7 μg/mL，相对误差小于5%，如图3。  详见原文图3. 标准参考浓度鉴定 3.2 ELISA法进行ζ-珠蛋白定量性能评估 用ELISA方法确定ζ-珠蛋白线性范围及LOD，如图4，线性范围为0.5-12.0 μg/mL；100 μL体积时，该方法LOD为0.05-1.20 μg/微孔。  详见原文图4. ELISA法定量检测ζ-珠蛋白LOD评估 用该方法定量前期纯化出的ζ-γ二聚体中的ζ-珠蛋白，以Pierce试剂盒检测结果为参照，该方法对ζ-珠蛋白定量具有高特异性。同时，以正常样本为基质，用纯化的ζ-珠蛋白制备低(1.0 μg/mL)、中(5.0 μg/mL)、高(10.0 μg/mL)三种浓度样本进行检测，平均回收率为95.5%，说明血浆中其他血红蛋白或蛋白的存在对定量结果无显著影响。 3.3 ELISA法队列研究及串联质谱法独立性验证 将该ELISA方法应用于6179例外周血样本进行队列分析。在100例正常人样本中未检出ζ-珠蛋白，在6079例--SEA/αα携带者中，成功检测出ζ-珠蛋白，浓度范围为0.00155 g/L-1.48778 g/L。为了探究东南亚型缺失中ζ-珠蛋白基因重排是否影响ζ-珠蛋白表达水平，随机选取10个--SEA/αα样本进行多重连接依赖探针扩增(Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification, MLPA)，结果显示HBZ区域拷贝数正常，说明该区域可能并非拷贝数变异热点。 规模化检测结果显示，多数样本的ζ-珠蛋白表达相对较低，如图5A。研究随即引入LC-MS/MS进行独立验证，该方法优选出唯一、稳定的ζ-珠蛋白肽段片段，挑选三对离子对，进行MRM靶向蛋白定量检测，以目标离子强度之和与同位素内标离子强度之和的比值作为相对信号强度，与ELISA检测的S/CO值进行直接比较，两组结果存在显著正相关(r=0.400，p<0.001)，如图5B。同时，提取LC-MS/MS检测到的相对信号强度最高或最低的样本共60个，评估其与ELISA结果的相关性，结果显示r值有显著升高(r=0.650，p<0.001，如图5C)。因此，本研究提出的ELISA方法和LC-MS/MS方法可灵敏的检测出--SEA/αα携带者中极高或极低的ζ-珠蛋白表达。  详见原文图5. 6079例--SEA/αα携带者ζ-珠蛋白分布及LC-MS/MS相关性分析 研究结论 本研究首次实现了基于ELISA方法的--SEA/αα携带者ζ-珠蛋白精准定量，并通过LC-MS/MS这一非抗体检测方法独立验证可行，为研究者们提供了一种可靠的通过ζ-珠蛋白的极端表达发现--SEA/αα携带者的方法。这为后续开展α-地贫基因型—表型研究及基因治疗奠定了坚实基础。 同时，基于质谱的血红蛋白亚基精准定量策略也可进一步拓展至其他地贫基因携带者或患者体内差异化表达的血红蛋白亚基，用于各类地贫基因型携带者乃至血红蛋白病患者的鉴别，解决现行地贫筛查方法中HPLC等血红蛋白分析方法高漏检率的弊端。此研究策略不仅回答了基因型与临床指征之间的差异问题，也为地贫的防控筛查提供了更多新思路。 |
|
|
