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人类基因组包含约30亿个DNA碱基对，所有的遗传秘密都蕴藏其中，一旦基因出现错误，就会引起严重的后果，这也是所谓的遗传疾病的来源。从20世纪中期开始的分子生物学革命，使人类在破译基因的遗传密码方面不断取得突破，科学家们于是想进一步通过修改基因来从根本上治愈疾病，随着理论的不断积累，基因编辑技术的应用日益显现。 基因编辑（Gene editing）是指特异性改变基因序列，利用酶（特别是核酸酶）来对DNA链进行剪切，移除已有的DNA，或者插入代替的DNA。它的基本原理其实有点类似于word程序中的查找、替换或者删减过程，即人为地修饰宿主细胞DNA序列，以实现对特定目的基因片段的“编辑”（即敲除/敲入），从而达到改变宿主细胞的基因型的目的。 基因编辑技术仿佛是一把有魔力的“剪刀”，它既可以“剪切”基因，也可以应用于“修补”基因。通过对DNA序列的改变和修正，破坏有毒或抑制性基因的功能（或恢复必要基因的功能），来实现遗传治疗。 随着科学技术不断进步，基因编辑技术日趋成熟，对基因组的编辑也变得越来越简单，特别是第三代技术CRISPR/Cas9的出现「CRISPR/Cas9目前被认为是最简单高效的基因编辑手段」。本文将带着大家回顾一下基因编辑的发展历史。 基因编辑发展历程资料来源: Synthego官网 同源重组技术(homologous recombination, HR)是最早的基因编辑技术，也是真核生物基因编辑的一个重大突破。其原理是将外源性目的基因导入受体细胞，通过同源序列交换，使外源性DNA片段取代原位点上的基因，从而达到使特定基因失活或修复缺陷基因的目的。但是对高等真核生物来说，外源DNA与目的DNA自然重组率非常低，只有1/10E7—1/10E6；若要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，至少需要两代遗传，因此HR的大规模应用受到了一定的限制。 为应对这一挑战，一系列基于核酸酶的基因编辑技术相继出现，实现了在真核生物尤其是哺乳动物中精准有效的基因编辑。与传统的基因编辑技术相比，基于核酸酶的基因编辑技术减少了外源基因随机插入，提高了对基因组特定片段进行精确修饰的几率。基于DNA核酸酶的基因编辑技术发展迅速，从第一代DNA核酸酶编辑系统ZFN、第二代TALEN到第三代CRISPR/Cas9系统，基因编辑效率不断提高、成本逐渐降低，应用范围不断扩大。 1. 锌指核酸酶技术（ZFN）
出现时间：1996年 组成单元：DNA结合的锌指蛋白区域（负责识别DNA位点）和限制性核酸内切酶FokⅠ的核酸酶切活性区域（负责切割DNA） 该技术使人工定点诱导双链DNA断裂成为现实，实现了基因编辑技术里程碑式的突破；2001年开始陆续用于不同物种的基因编辑，构建基因编辑模式生物的同时也用于遗传育种和基因治疗。 ZFN的结构及作用原理图 2. 转录激活效应因子核酸酶（TALEN）技术
出现时间：2009年 组成单元：识别特异DNA序列的转录激活效应蛋白(transcription-activator-like effector，TALE)和核酸内切酶FokⅠ（组成与ZFN类似） 该技术大大提高编程性能，设计简单，自2011年建立后迅速用于构建基因修饰动物模型、遗传育种和基因治疗等领域，并入选为2012年的《科学》（Science）年度十大科技突破之一。 TALEN的结构及作用原理图 3. CRISPR/Cas系统介导的基因编辑技术
出现时间：2012年 CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌中进化出来用于抵御噬菌体及外源DNA入侵的适应性免疫系统，通过CRISPR RNA (crRNA)和trans-activating crRNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白组成的复合体抵御外源性DNA的入侵。 当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。 组成单元：由Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)组成，sgRNA是根据crRNA和tracrRNA形成的高级结构设计的。人工设计的gRNA（ guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等。 基因编辑技术的基本原理，图片来自origene.com 根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。 由于该技术较前两代技术设计和制备更加简单，成本更低，编辑效率更高，CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。连续多年被《Nature》评为最有前景的技术之一，2015年被《Science》评为技术突破第一名，2014、2016年被《麻省理工科技评论》评为10项突破技术之一，2020年诺贝尔化学奖。 近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。 三代基因编辑技术对比资料
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