五、mNGS实验流程建立
mNGS湿实验环节的方法学建立主要涉及核酸提取、建库等流程,在检测体系建立时,需进行充分评估。第一,不同的提取试剂对细菌、真菌、病毒的核酸提取效率存在差异[40, 41, 42]。同时,提取流程中是否有破壁过程以及破壁的条件也会影响核酸提取效率[12]。第二,根据已发表的专家共识,当临床标本中宿主细胞浓度高时,为提高低载量病原体的检出率,建议添加去宿主过程[42]。第三,mNGS应用于科学研究时多采用单份标本最低20M的测序数据量,但临床应用时需要多少测序数据量存在较大的争议。建议在建立方法学时,进行最低测序数据量的评估。第四,背景微生物的核酸片段是干扰mNGS结果的重要因素。建议在建立方法学时,根据实际情况建立背景核酸数据模型[1,5,16],协和方案如下。
(一)核酸提取效率评估
使用固定CFU的代表性菌株,使用Qiagen的提取试剂盒提取核酸,并使用微滴式数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)进行定量,每一菌株重复3次以计算均值;以阴性BALF剩余标本为基质,加入固定CFU的代表性菌株制备模拟标本,以实验室拟使用的提取流程进行核酸提取,使用ddPCR进行定量,并重复3次以计算均值;计算两者间比值,定义为提取流程对代表性菌株的提取效率。
(二)去宿主病原体损耗评估
去宿主病原体损耗评估参考盘制备:拟投入的病原体为鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、白色念珠菌、烟曲霉、表皮葡萄球菌、巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)和腺病毒,每种病原体浓度拟设定为1 000 拷贝/ml,每份标本中宿主细胞浓度拟控制在105 细胞数/ml。
随机选择6份模拟标本平均分为2组,一组使用去宿主试剂进行处理,另一组不进行去宿主处理,获得核酸后同时进行建库测序和ddPCR。
统计分析2组不同处理标本目标病原体每百万序列数(reads per million,RPM)和定量结果的差异。
统计分析2组标本宿主基因组比率和内参基因定量结果的差异。
(三)最低测序数据量评估
1.DNA流程最低测序数据量参考盘制备:拟投入病原体同“五(二)”中使用的病原体。分别使用宿主细胞浓度为105 细胞数/ml和107 细胞数/ml的肺泡灌洗液剩余标本作为稀释基质[38],建议每种病原体浓度1 000 拷贝/ml,不同宿主浓度梯度的标本建议重复检测不少于5次[5]。
2.RNA流程最低测序数据量参考盘制备:拟投入病原体甲型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒,每种病原体浓度为1 000 拷贝/ml(参考ddPCR结果)。宿主细胞浓度同DNA流程最低测序数据量参考盘。不同宿主浓度梯度的模拟标本建议重复检测不少于5次[5]。
3.最低测序数据量评估:每份标本的测序数据量为400 兆(megabyte,M)reads,随机抽取12.5、25、50和100 M各20次分别进行生信分析流程进行分析,通过probit回归分析合理的最低测序数据量。
(四)建立试剂及环境背景核酸数据库
1.试剂工程菌背景核酸的建立:(1)酒精清洁双手,建议准备好2 ml EP管12个,在试剂准备间超净工作台内,每个EP管中分装1 ml生理盐水并编号;(2)将标本随机平分为2组,分别使用去宿主流程和不去宿主流程进行测序;(3)测序后,分析去宿主流程和不去宿主流程的微生物检出情况和相对丰度。
2.实验室空间和设备表面背景核酸的建立:(1)酒精清洁双手,按照实验室实际情况准备2 ml EP管若干,在核酸提取区生物安全柜中分装1 ml 生理盐水至每个EP管中并编号。(2)使用无菌拭子分别对每个实验区的台面和设备(实验台面、生物安全柜、离心机孔位及表面、均质仪孔位及表面、PCR扩增仪孔位及表面、涡旋震荡仪表面、恒温金属浴孔位及表面、测序仪表面、操作人员手部、口罩外层等)进行擦拭采集环境标本,将拭子装入EP管中进行振荡混匀。建议同一位置连续3 d进行标本采集。为便于数据统计,建议每批次实验设置1份未采集环境标本的拭子作为空白对照。(3)测序后,分析各位置的微生物组成和相对丰度,建立实验室操作空间和设备背景核酸数据模型。
(五)质量控制点和风险控制点设置
建议测定提取核酸的浓度和纯度,DNA/RNA的A260/A280比值不低于1.8/2.0。文库构建完成时再次测定核酸浓度和纯度,当文库浓度低于0.1 ng/μl时,建议重新实验。同时,建议测序数据量和测序质量值作为质量控制点之一,当测序数据量低于最低测序量或Q30低于80%时,建议重复检测。同时,本方案建议在标本中加入经过ddPCR定量摩尔浓度的大肠杆菌噬菌体(DNA流程使用T7噬菌体,RNA流程使用M2噬菌体)作为内标;建议每轮实验同时检测3倍最低检出限(limit of detection,LoD)浓度的弱阳性质控、10倍LoD浓度的阳性质控和阴性质控。