【原】心肌梗塞期间动态间质细胞反应预示着遗传多样性小鼠对损伤的适应性

健明 2022-09-27 发布于广东

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文章信息

文章题目：Dynamic Interstitial Cell Response during Myocardial Infarction Predicts Resilience to Rupture in Genetically Diverse Mice
期刊：Cell Reports (IF：9.995 Q1)
日期：2020/3/3
DOI：https:///10.1016/j.celrep.2020.02.008

摘要

为了阐明疤痕形成的细胞过程，本篇文章从携带标记心外膜细胞源性细胞遗传示踪剂的心肌梗塞小鼠day0，day1，day3，day5，day7，day14，day28的心脏中分离出来的间质细胞进行了无偏倚的单细胞mRNA测序。数据分析揭示了16个间质细胞群，其中5个起源于心外膜。比较了C57BL/6J和129S1/SvImJ 两种小鼠梗死后心脏转录谱，发现129S1/SvImJ小鼠心脏中出现早期激活的myofibroblast增加、胶原沉积增强和持续的急性期反应。确定了预测疾病结果的病理重塑的关键时间窗口。

方法

取得心肌间质细胞，去除心肌细胞、碎片和死细胞，使用基于磁珠的死细胞消耗和有核（DRAQ+）活细胞（DAPI）分选。共有7只小鼠的36,847个活的、有核的间质细胞在平衡期和MI后第1和3天（炎症期）、5和7天（增殖期）、14和28天（成熟期）被捕获。

结果

1 scRNA-seq分析确定了心肌梗塞后的间质细胞（interstitial）图谱。

在不同时间点，取得的样本按照图1A 分选的细胞，whole-mount 图像显示，损伤后强度增加，从全心激活（d1）到梗死边缘区（d3-d5），再到瘢痕区（d5-d28）（图1B）。ZsGreen⁺ 细胞在晚期重塑阶段增加，表明成熟疤痕中存在心外膜细胞（图1C）。单细胞转录组的全局聚类显示了16个主要群体，由每个聚类中优先出现的标记基因识别（图1D-1G）。

标志着心外膜来源的ZsGreen表达在五个集群中占优势：心外膜、平滑肌和成纤维细胞I-III型（图1E）。

2 疤痕形成过程中基质细胞（stromal）亚群的动态变化。

研究者的精力集中在基质细胞中，作者将其中的fibroblast types I-III, myofb,间皮心外膜细胞群重聚类成12个亚群（图2A,B）。HEpiDs的特点是与有机物质和代谢相关的基因的表达水平相对较高: Dpep1是一种依赖锌的金属蛋白酶，参与谷胱甘肽和白三烯的代谢，可能在TGF-b诱导的上皮-间质转化中发挥作用。Lpl，对脂蛋白的三酯代谢的重要因素；Hsd11b1，将皮质醇转化为非活性形式可的松，并可能影响皮肤成纤维细胞的增殖(Terao等人，2014年）；以及多效性趋化因子Cxcl14。

图2D中，SPRING分析展示出EpiD细胞到ZsGreen⁺ myofb的可能性。type II fibro 更像是个独立的细胞亚群，其基因特征与瓣膜小叶相关，相关度最高的经典途径是参与软骨内化和wnt信号传导的以及其他GO term中与解剖学位置结构形态发生和发展相关。

图3中，88.5%±2.27%的心室中的DKK3⁺ 细胞与TekCre中的ZsGreen共同标记。

在Tek^Cre;ZsGreen^f/+小鼠中，有88.5%±2.27%的DKK3+细胞与ZsGreen共同标记（追踪心内膜衍生的细胞），而88.05%±4.02%的EndD细胞在在Wt1^Cre;RosaZsGreenf^/+小鼠中用ZsGreen^-标记。图中展示了稳态情况下冠状动脉血管和瓣膜成纤维细胞表达DKK3，可以据此推测EndD作为fibro的亚群是由于其胚胎来源而不是一种激活状态。

另一个ZsGreen⁺ EpiD 细胞表达高水平的Mt1-2（下面图4）。图4A展示不同亚群的基因表达，图4B 中看到IR 亚群高表达单核细胞-巨噬细胞的趋化因子，图4C展示IR亚群的GO富集分析。对基质细胞中高表达MT1-2进行验证，发现其主要在CD45⁺细胞中表达（图4D-4E），全局性的激活主要在d1的 EpiD中检测到。d3时候，MT1-2⁺基质细胞减少且主要集中在疤痕区域。d5，MT1-2⁺主要局限于CD45⁺细胞和心外膜细胞。图4F，SPRING分析展示出IR的亚群d1是高表达Mt1-2、fibroblast marker、stromal基因，到d3低表达Mt1-2，高表达myofb marker，据此推测，IR细胞快速转变到myofb。之前的报道是myofb在心肌梗塞后d7之前不会出现。

MFC(matrifibrocyte,基质纤维细胞)和EndD fibro一样，表达成骨细胞、软骨细胞相关基因，如comp，ECM（下面图5）。ACTA2,CTHRC1作为myofb marker SFRP2，CLU作为MFCmarker，染了免疫荧光看MFC和myofb之间的转化（图5B）。d3开始myofb的ACTA2 展示出比SMC低的特征，d14-d28局限于血管附近；而myofb CTHRC1主要集中于后期。MFC中的SFRP2,CLU主要在后期逐渐增加。CLU也在激活的心内膜和心外膜中表达（图5C）。在MI后5-14天，对从心脏疤痕和远端心肌区域分离出来的Col1a1-EGFP⁺ 基质细胞进行qPCR分析，证实Myofb标记物Acta2和Tnc在MI后5-14天较高（图5D）。在增殖期（MI后第5-14天），疤痕区的Myofb标志物Acta2和Tnc明显较高。在增殖期（第5天）疤痕中明显升高，而MFC标志物 Ecrg4、Comp、Sfrp2、Thbs4、Wisp2、Meox1和Col8a1在d14时被上调。与对照组相比，Meox1、Comp、Ecrg4和Col8a1在第5天的远端区域没有显著变化，证实了它们在LR成纤维细胞中的富集。这些结果强调了心脏损伤的动态基质反应。

3 遗传决定的因素赋予心脏损伤的韧性。

有研究报道，遗传背景决定了初始心脏基质细胞组成的差异，可能影响心血管疾病的替代纤维化过程。研究者利用近交系小鼠品系的遗传多样性来研究对MI反应的变异：C57BL/6J或B6J（对照），129S1/SvlmJ或129（易患高血压），DBA/2J（易患钙化），NOD/ShiLtJ（易患1型糖尿病），NZO/HLtJ（肥胖），A/J (易患肌肉萎缩症），以及三个野生品系 (CAST/EiJ, WSB/EiJ, and PWK/PhJ)（下面图6）。图6A展示了不同品系鼠在心肌梗塞一个月后的存活情况。为了了解129S1鼠破裂损伤倾向性，对其心肌梗塞后3天的间质细胞(cardiac interstital cell)做单细胞测序，用B6J作为对照（图6B,C,D）。

在基质细胞（stromal cell）里，两种品系的小鼠中有3922个基因表达不同。对这些基因进行PANTHER分析后，发现主要富集在炎症反应、受体酪氨酸激酶信号、细胞迁移、ECM结构、胶原形成（下面图7A）。ECM相中在ECM成分中弹性蛋白（Eln, Emilin2, 纤维素，微纤维相关蛋白）在损伤的129小鼠表达更低，而抗拉胶原（Fn1, Tnc, Thbs1, Vcan）在129小鼠中表达更高。心肌梗塞后，ECM成分中参与炎症反应的ECM成分（Hif1a, Timp1, F2r）以及凝血基因（F2r、Pf4）和纤维蛋白溶解的负面调节因子在 (Serpine1, Thbs1）129小鼠中后被上调（图7C,D）。图E展示了qPCR验证不同样本中基因的表达情况。