院企合作：史渊源王琦团队合作探究中药复方ECD治疗骨质疏松药效与机制

”

中医药传承久远，卷帙浩繁，留下了很多宝贵的临床经验并应用至今。然而，中医药发展至今，仍多以个人、各派临床经验的应用为主，其发挥作用的范围，和纵向的时间长度，都很受局限。2016年，国务院发布《中国的中医药》白皮书，指出“中医药发展上升为国家战略，中医药发展事业进入新的历史时期”。在中医药发展的新的历史时期，想要真正的推广中医药，将其应用价值达到最大化，便是要尽可能的将中医药用科学的方法，将其药效验证明确，成分解释清楚，机制阐述严谨。

知名免疫学期刊《Frontiers in Immunology》英文网址：

https://www./articles/10.3389/fphar.2021.772944/abstract

近期，深圳北京中医药大学研究院史渊源教授团队与多机构合作，通过动物、细胞实验，网络药理学分析等手段，研究了中药复方ECD（三味中药组合，即杜仲，菟丝子和骨碎补）对糖皮质激素型骨质疏松的治疗作用及作用机制。其主要结果以题为“Eucommia, Cuscuta and Drynaria Extracts Ameliorate Glucocorticoid-induced Osteoporosis by Inhibiting Osteoclastogenesis through PI3K/Akt Pathway”的论文被国际知名药学期刊《Frontiers in Pharmacology》接收，2021年影响因子为5.81分。

该研究联合了北中医深研院以及北京中医药大学生命科学学院、中医学院，内蒙古医科大学，美国中药复方品牌原料商Chenland Nutritions Inc，美国康奈尔大学医学院等机构的研究人员共同完成，利用多种实验手段为中药复方治疗骨质疏松的现代化研究和分子机制挖掘提供了新的思路。

论文通讯作者为北京中医药大学特聘教授，深圳北京中医药大学研究院执行院长史渊源；中国工程院院士，国医大师，北京中医药大学教授王琦；Chenland Nutritions公司刘自民教授。两位共同第一作者为史渊源教授与王琦教授联合培养博士生韩珺雯和Chenland Nutritions公司研究员李莉。

骨质疏松症世界上最常见的疾病之一，随着老龄化进展和环境药物等因素影响，骨质疏松的发病率和发病人数逐渐增加，造成了沉重的社会经济负担和公共卫生威胁。其中，糖皮质激素诱导的骨质疏松症 (GIO) 是造成骨质疏松症的第二大原因, 其发病率逐年升高，且GIO进展迅速，后果严重，无一定的年龄影响。目前，治疗骨质疏松的药物主要有双膦酸盐、选择性雌激素和 RANKL 抑制剂等，如denosumab，以及特立帕肽。尽管已将多种疗法应用于临床治疗，但骨质疏松患者仍存在较高的骨折风险和副作用。新药的副作用和长期影响推动了开发新疗法的必要性。

ECD由三味中药组成：杜仲、菟丝子和骨碎补。这三位中药在中医理论中皆有补肾壮骨的功效，且常联合使用于中药复方对于骨质疏松的临床治疗。但ECD发挥抗骨质疏松效果的作用机制仍不十分清楚，因此，本研究具有十分重要的临床意义。     

 

 图1：(A)大鼠体重变化(n=8). (B)大鼠体温变化(n=8). (C)大鼠24小时尿钙(n=8). 

(D) 大鼠24小时尿磷(n=8). (E) 大鼠血清钙含量(n=8).  (F)大鼠血清磷含量(n=8).    

史渊源团队首先通过动物实验，验证了ECD对大鼠GIO的症状改善作用。实验大鼠被分为空白对照组（Control），糖皮质激素诱导骨质疏松模型组（Model）,ECD低剂量组（ECD-L）,ECD中剂量组（ECD-M）和ECD高剂量组（ECD-H），通过对大鼠血尿钙磷水平检测，及大鼠体重、体温的检测，发现ECD可显著改善GIO大鼠的钙磷流失，以及减轻GIO大鼠的体重下降。（图1）

图2：(A)大鼠骨髓H&E染色. (B)大鼠骨髓脂肪浸润统计. (C)大鼠股骨TRAP染色. 

(D-G)大鼠血清ELISA检测(n=8). (H,I)大鼠股骨生物力学测试(n=8).

同时，通过胫骨病理切片及TRAP染色，发现ECD可减轻GIO大鼠的骨髓脂肪浸润，减少骨小梁的破骨细胞活性。对GIO大鼠血清相关蛋白水平检测显示，GC造模导致大鼠血清与破骨细胞活动相关蛋白表达升高，如RANKL，NTx，而与成骨细胞活动相关蛋白表达水平OPG被抑制，ECD给药可抑制RANKL，NTx表达，并提高血清OPG水平。同时生物力学功能测试显示，ECD可提高GIO大鼠的骨应力强度。（图2）

图3：(A)micro-CT扫描. (B-G)大鼠股骨骨体积/总体积(BV/TV), 小梁厚度(Tb.Th), 小梁分离 (Tb.Sp),小梁数量(Tb.N), 结构指数(SMI), 骨密度(BMD) (n=8).

团队进一步对大鼠胫骨进行了micro-CT扫描，结果显示，ECD可提高GIO大鼠的骨小梁密度，骨密度，骨小梁连续性及骨体积等相关参数。且具有明显的剂量依赖性，高剂量组效果优于低剂量组。（图3）

 

图4：(A)TRAP染色. (B)F-actin染色. (C-D) CCK8 asay. (E)TRAP阳性细胞统计. (F-H) TRAP, NFATC1, RANKL的mRNA表达水平(n=3). (I) TRAP, NFATC1, RANKL的蛋白表达水平(n=3).

在骨代谢的过程中，破骨细胞和成骨细胞之间的动态平衡尤为重要。我们选用Raw264.7细胞系进行破骨细胞相关实验。CCK8实验结果显示，ECD对Raw264.7细胞无毒性作用。进一步实验用RANKL诱导Raw264.7向破骨细胞分化，并用ECD进行体外干预，从RNA和蛋白表达两个层面进行验证，qPCR和Western Blot结果显示，ECD可抑制 Raw 264.7 细胞分化为破骨细胞，降低其RANKL，NFATc1, TRAP等基因的表达。且随着剂量增加，抑制作用愈明显。同时，TRAP染色和F-actin免疫荧光染色结果表明，ECD可显著抑制破骨细胞形成和其功能。（图4）

图5：(A)小鼠原代骨髓间充质干细胞. (B,C) CCK8 assay. (D-F) MSC中OPG, WNT1, RUNX2的mRNA表达水平(n=3). (G) TRAP染色. (H-J) Raw264.7中RANKL, TRAP, NFATC1的mRNA表达水平(n=3).

另一方面，我们提取了小鼠的骨髓间充质干细胞（MSC）,其可以在一定的条件下向成骨细胞分化。我们发现ECD可以提高MSC与成骨细胞形成相关的 OPG、Wnt1、Runx2 等蛋白的表达。用E.C.D处理MSC得到条件培养基（CM）可抑制Raw264.7细胞向破骨细胞方向分化。（图5）

图6：ECD质谱分析和关键成分分析.

图7：PPI网络图，KEGG分析和GO分析.

为了进一步研究ECD对改善GIO的作用机制，研究团队对ECD进行了质谱分析和网络药理学分析，确定了ECD中的43中主要成分，并发现了ECD介导的治疗 骨质疏松的可能靶点和通路。其中，PI3K/Akt通路被最多的蛋白靶点锚定，表明其可能是ECD发挥抗骨质疏松作用的关键机制。（图6，图7）

 

图8：Western blot检测PI3K/Akt通路上各个关键蛋白表达情况(n=3).

 接下来，研究团队应用Western bloting对通路上的关键蛋白进行检测，发现ECD可抑制PI3K表达和Akt的磷酸化，同时，我们使用了PI3K蛋白抑制剂进一步佐证我们的假设。发现抑制PI3K可抑制Akt磷酸化，进而抑制RANKL表达。证明了ECD主要通过抑制PI3K/Akt通路进而下调RANKL表达，抑制破骨细胞形成。（图8）

讨论

骨质疏松是由于骨代谢失衡导致，这是一个由多种细胞参与的动态平衡过程。以往的药物往往集中于单个靶点和作用机制，因而不能很好地顾及整个平衡的动态维持。而中药复方的多靶点、多通路的特点，使其能更好的兼顾骨代谢的各个方面。史渊源团队的研究表明，中药复方ECD既可以抑制破骨细胞的分化和功能，减少骨吸收，另一方面，又可以促进成骨细胞的形成，通过双向调节，抑制骨质疏松的发生。

目前，临床治疗骨质疏松症的方法多为磷酸盐补充剂或通过 RANKL/OPG 通路调节骨代谢靶向治疗。MAPK/NF-κB 和 Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号通路也被证明在破骨细胞发生中发挥重要作用。而PI3K/Akt 通路是调节细胞增殖和存活的关键信号通路。已有一些研究发现 PI3K/Akt信号通路可以促进破骨细胞形成，且可以调控NFATc1的表达抑制破骨细胞。但单纯的PI3K/Akt抑制剂同时会显著抑制细胞的增殖和活性，甚至诱发细胞凋亡，因而很难应用于临床治疗。本研究团队通过网络药理学分析，Western blot验证，及通路抑制剂的使用，验证了ECD可通过PI3K/Akt通路调控RANKL蛋白表达，进而抑制破骨细胞形成和功能。同时，又不影响细胞的活性，而从另一个方面促进成骨细胞的形成，避免了单一通路抑制剂的副作用，为临床上应用ECD治疗骨质疏松提供了科学依据和支持。