 导语 今天给同学们分享一篇坏死性凋亡鉴定新型分子表型的生信文章“Necroptosis Identifies Novel Molecular Phenotypes and Influences Tumor Immune Microenvironment of Lung Adenocarcinoma”，这篇文章于2022年7月14日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。这项研究涉及30个坏死性凋亡相关基因，以显示它们在泛癌中的异质性，包括转录表达的变化，体细胞突变，拷贝数变异和DNA启动子甲基化。作者使用无监督聚类法鉴定了三种分子表型，将肿瘤坏死性凋亡与TME和LUAD中的分子变异相关联。构建了一个名为NecroScore的可靠预后评分系统，用于量化LUAD中的坏死性凋亡分子，并针对不同分层提出潜在的治疗策略，增强预后并在临床实践中实施更个性化的精准医疗。 1. 坏死性凋亡调节因子的表观遗传和转录特征 通过R软件包"DESeq2"，在TCGA-LUAD队列中共发现了30个差异表达的坏死性相关基因。这30个分子是ALK,AXL,BACH2,BNIP3,CDKN2A,CFLAR,DIABLO,DNMT1,FADD,GATA3,ID1,IDH1,IDH2,ITPK1,KLF9,LEF1,MPG,MYCN,OTULIN,PANX1,PLK1,SLC39A7,TERT,TLR3,TNFRSF1B,TNFRSF21,TNFSF10,TRAF2,TRIM11和ZBP1。为了揭示LUAD中坏死性调节因子的表观基因组学特征，作者分析了甲基化水平。结果表明，DNA启动子甲基化与TERT和GATA3的转录表达水平之间存在明显的负相关，而BACH2与其甲基化有微弱的正相关（图1A）。由于CNV可以影响整个基因组或在焦点水平上改变一个广泛的区域，引发对体细胞突变的更大影响，作者进一步描绘了这些基因的CNV景观。拷贝数值的探索显示了30个调节因子的异常改变，其中TERT和OTULIN有广泛的CNV扩增频率，而CDKN2A在LUAD中表现出显著的CNV缺失（图1B）。根据cBioPortal的泛癌突变分析，CDKN2A表现出最高的突变类型，有深度缺失，其次是TERT、TRIM和ZBP，扩增频率为11%。在561个LUAD样本中，111个出现了坏死性相关基因的突变，频率为19.79%。然而，说明ALK的突变频率最高，其次是CDKN2A，而剪接位点只在CDKN2A和IDH1中观察到（图1C）。  图1 肺腺癌细胞凋亡分子的表观遗传改变 研究发现，大多数调节因子在LUAD癌旁组织和肿瘤组织中的表达存在显著差异。在肿瘤病例中发现几个基因的表达水平较低，如AXL、BAHC2、CFLAR和DNMT1，而其他基因则过度表达，如BNIP3、DIABLO、FADD和IDH1。此外，BNIP3、DIABLO、DNMT1、FADD、LEF1、PANX1、PLK1、TNFRSF21和ZBP在从I到IV的不同病理阶段的表达发生了显著变化。对30个基因进行分层聚类，得到4个聚类：聚类A（TERT、MYCN和ALK）、聚类B（AXL、BNIP3、CFLAR、DIABLO、DNMT1、FADD、ID1、ITPK1、KLF9、MPG、PANX1、TLR3、TNFRSF1B、TRAF2、TRIM11）和聚类D（BACH2、CDKN2A、GATA3、LEF1、PLK1和ZBP1）。为了全面了解LUAD中坏死性相关基因的调控机制，作者收集了1064个样本，并使用“ComBat”方法校正了批次效应。作者发现，同一类别的坏死性调节因子在转录表达水平上表现出显著的正相关，并且在四种修饰模式之间显示出显著的相关性。根据log-rank检验，过度表达的DIABLO、FADD、ID1、MPG、TRIM11、PLK1、TNFRSF21和TERT与不良的总体生存结局相关，即风险因素，而ALK被认为是一个有利因素。单因素Cox模型显示FADD、PANX1、PLK1、TRIM11、TRAF2、TERT和ID1可能是风险因素，而ALK对预后有预防作用。上述结果强烈表明，坏死性调节基因之间的失衡与LUAD的肿瘤发生有关。  图2 基于无监督聚类确定三种坏死性表型 2. 无监督聚类法鉴定LUAD的新亚型 基于K-means的无监督学习方法被应用于对29例坏死性调节分子的患者进行分类。根据不同聚类的分布和累积分布函数（CDF），最终确定了最佳聚类和三种不同的坏死性表型，包括聚类A中的210例、聚类B中的578例和聚类C中的276例。PCA证实，这三个聚集亚型可以通过29个表达水平的坏死性相关分子来区分（图2B）。热图显示了坏死性调节因子的表达变化。坏死性相关基因在聚类C中的表达水平最高，其次是聚类B，然后是聚类A（图2C）。临床病理表型的分布，包括年龄、性别、吸烟史、复发情况和病理分期，也通过Fisher精确检验在三个坏死性聚类群中同时进行检查。作者发现聚类B和聚类C女性患者较多。聚类A患者吸烟的可能性更大。早期患者（I期或II期）大多来自聚类B。三种主要坏死性表型的KM生存分析显示，聚类B的预后优势相对突出（图2D）。单因素和多因素Cox比例风险回归模型表明，聚类B与聚类C一起可以预测LUAD的总体生存率。此外，年龄和分期也是生存率的潜在预测因素。 3. 不同坏死性表型的TME免疫变异 由于癌症免疫在肿瘤进展和细胞增殖中起着关键作用，作者推测不同聚集亚型的肿瘤免疫微环境可能是不同的。作者首先研究了坏死性表型与多种免疫调节剂和免疫检查点之间的相关性。坏死性对肿瘤免疫微环境的影响结果表明，聚类B和C中存在趋化因子的显著上调表达水平，如CCL11、CCR1、CXCL10和PPBP（图3A）。白细胞介素、干扰素、受体和其他一些细胞因子的表达在聚类B和聚类C中也有所增加，而聚类A的免疫分子水平显著下调（图3A）。与聚类A和聚类B相比，聚类C表现出七种免疫分子的最高表达，这些免疫分子显示了免疫治疗的潜在靶点，包括CD274（PD-L1）、PDCD1（PD-1）、CD247、PDCD1LG2（PD-L2）、CTLA-4、TNFRSF9和TNFRSF4（图3B）。  图3 三种坏死性表型中免疫调节剂和几种量化类型的肿瘤免疫微环境的改变 作者进一步调查了20种免疫细胞类型的浸润水平以及免疫周期中每个步骤的水平。基因特征的研究表明，聚类B免疫细胞浸润率显著高于聚类C，而聚类A免疫细胞渗透率显著低于聚类B，如CD4+原始T细胞、滤泡辅助T细胞和M1巨噬细胞（图3B）。值得注意的是，活化记忆CD4+T细胞在B聚类中的丰度最低，但在聚类A和聚类C中的含量较高。通过ssGSEA算法计算在消灭肿瘤细胞的每个步骤中发生的抗肿瘤免疫反应事件所定义的七个免疫周期信号的得分。所有步骤在聚类B和聚类C中得分较高，但在聚类A中得分特别低（图3B）。此外，A聚类还具有明显的MeTIL缺陷，这表明肿瘤浸润免疫细胞的比例较低（图3B）。 作者还采用TIDE算法和ESTIMATE方法比较了TME免疫亚型中免疫组分和基质组分的异质性。因此，可以量化坏死性部分与潜在免疫治疗效果之间的相关性。研究发现，聚类B的TIDE和功能障碍得分最高，其次是聚类C，然后是聚类A，而排除分析的结果则相反。组别B和C的免疫和基质得分显著高于组别A，表明聚类A的肿瘤纯度最高（图3B）。此外，作者还研究了几种免疫途径的生物标记物。结果表明，功能的标准化富集分数明显较高，主要位于聚类C，包括共同抑制APC、检查点、炎症促进、MHCI类、副炎症、共同抑制/刺激T细胞和I型IFN反应（图3C）。聚类BAPC、CCR、细胞溶解活性、HLA和II型IFN反应的联合刺激得分相对较高，而聚类A的丰度最低（图3C）。通过相关策略，包括ALK、AXL、KLF9、LEF1、TNFRSF1B和ZBP1在内的几个坏死性调节基因与大多数免疫细胞呈正相关，而BNIP3、DIABLO、FADD、IDH1、IDH2、PLK1和SLC39A7等分子呈负相关（图3D）。 4. 坏死性表型间基因组变化的描述 作者进一步探索了已鉴定的LUAD分子表型的基因组差异，包括突变特征、SNV和转录因子调控网络的活性。发现聚类A和聚类C的TMB显著高于聚类B（图4A，B）。作者推断四个突变特征与LUAD相关，即SBS1（年龄相关）、SBS2（APOBEC活性相关）、SBS4（吸烟相关）和SBS5（ERCC2突变相关）。然而，仅在SBS1中检测到统计显著性，表明聚类B与聚类A相比，年龄相关特征的突变更多（图4A），聚类A与聚类C相比，吸烟相关特征的变异频率更高，其次是聚类B（图4A）。因此，这些突变特征可以解释每个分子坏死性表型的扰动。在前20个频繁突变的基因中，作者发现聚类C的TP53、TTN、MUC16、CSMD3和RYR2突变更为丰富，聚类B的突变频率相对聚类a和聚类C更低（图4A）。在聚类B和C中，拷贝数扩增和删除的负担降低了，但在聚类A中，无论是在焦点层面还是手臂层面，拷贝数的扩增和删除负担都显著增加，聚类B的CNV负担显著降低（图4C）。研究了不同染色体中CNV和GISTIC得分分布的频率，验证了作者的结果，并表明增益和损耗之间的最极端频率差异位于第8和14号染色体上。  图4 三种坏死性表型之间基因组特征的区别 为了进一步分析各组之间的转录组差异，共调查了8种LUAD特异性转录因子和15种与癌症染色质重塑相关的潜在调节因子。作者确认了三个坏死性聚类的生物学相关性，因为调节子活性与聚类密切相关（图4D）。聚类A和聚类C具有相似的调节子活性模式，而聚类A具有较高的FOXA2和ATOH8活性，聚类C与活化的HOXA4显著相关。聚类B含有高浓度的调节子，如HOXA4、DACH1、EPAS1、ETV5、FOXA2、ATOH8和SMAD6。与癌染色质重塑相关的调节子活性信息强调了三种坏死性表型之间的可选可行差异调节模式，表明表观遗传驱动的转录网络可能是这些聚类的重要分化因子（图4D）。作者发现聚类A和聚类C也具有相似的调节子模式，而聚类A的SIRT1、SIRT4和SIRT5活性较高。同时，聚类B中SIRT1，CLOCK，EP300，HDAC5，SIRT4，SIRT2，HDAC10和HDAC8的调节子显著富集。 5. 信号通路功能障碍 作者探索了三种坏死性表型之间基因表达的差异，并分析了几种癌症相关信号通路的特征，这有助于了解潜在的调节机制和药物途径。坏死性调节分子与激活的途径相关，如凋亡、细胞周期A、EMT-A和激素AR-A，但在泛癌中持续抑制细胞周期I、激素AR/ER-I和RTK-I等功能（图5A）。在LUAD中，大多数坏死性相关基因激活了细胞周期、EMT和凋亡等途径，而它们抑制了激素ER和RTK信号（图5B）。作者使用语义相似性来聚集紧密相关的类别，以在参与坏死性的30个调控因子中筛选关键基因。结果表明，TNFRSF21的重量最高，其次是DIABLO和TRAF2（图5C）。为了分析这些不同坏死性表型的生物学行为，作者进行了GSVA富集探索。如图5D所示，聚类A在RNA聚合酶、氨酰tRNA生物合成、同源重组和DNA复制中显著富集。B组包括与病毒性心肌炎相关的生物途径、细胞粘附分子（CAMs）、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和造血细胞系。此外，C聚类在原发性免疫缺陷、IGA生成的肠道免疫网络、细胞周期、DNA复制、错配修复和碱基切除修复中显著富集。作者还评估了不同聚集亚型中的其他癌症病理。聚类B的NOTCH、NRF2、RAS和TGFβ得分显著较高，而聚类C的细胞周期和TP53信号通路被激活（图5E）。此外，还研究了这三种表型与cGASSTING信号通路之间的关联。结果表明，cGAS、IRF3和TBK1在聚类C中表达水平最高，但在聚类A中表达下调程度最高，这意味着坏死性在形成肿瘤免疫微环境和免疫反应方面的重要性，并进一步表明坏死性在LUAD化疗和免疫治疗中的潜在可行性。  图5 坏死性和癌症相关信号通路的研究 6. 坏死性凋亡评分系统的临床价值 然后，作者根据与坏死性相关的分子开发了一个名为NecroScore的评分系统，以测量LUAD患者的坏死性水平。在TCGA和GEO荟萃队列的最佳临界值处，患者被单独分为低NecroScore组和高NecroScore组，其中TCGA-LUAD的值在-3.80处测定，GEO的值在-0.22处测定。通过比较三个聚类亚型中的NecroScore水平，Welch单向方差分析测试显示，NecroScore在聚类C中最高，其次是聚类A，然后是聚类B（图6A）。根据TCGA（图6B）和GEO队列（图6C）的KM生存分析，NecroScore较高的患者的预后比NecroScore较低的患者差。不仅如此，不同临床分层的患者，包括年轻人和老年人、女性和男性以及早期和晚期患者，也具有生存意义。在高NecroScore组中发现较高的不吸烟率和更多的晚期患者，而年龄和性别分布没有统计差异（图6D）。单因素Cox模型显示年龄、病理分期和NecroScore与生存率显著相关（图6E），多元Cox回归证实年龄，分期和NecroScore可以作为独立的预后因素（图6E）。通过t检验确定低NecroScore患者与高NecroScore患者相比的显著治疗优势（图6F）。在三个独立的预后因素中，分期显示出最高的净获益，其次是年龄，然后是NecroScore（图6G）。此外，根据决策分析，三个因素的组合在3年、5年和10年内的净收益水平最高（图6G）。建立诺模图模型来预测LUAD患者的1年、3年和5年生存率（补充图9A）。作者还发现，低TMB和高NecroScore相结合的患者预后较差，而高TMB和低NecroScore的患者显示出明显的优势（图6H）。  图6 NecroScore的临床意义 作者进一步研究了免疫细胞浸润水平之间的相关性。免疫细胞浸润表明几种细胞类型的浸润丰度与NecroScore呈负相关，如髓样树突状细胞、癌相关成纤维细胞、造血干细胞和单核细胞。大多数体征呈负相关，尤其是在内皮细胞、静息树突状细胞和静息肥大细胞中，在激活记忆CD4+T细胞和成纤维细胞中发现弱相关。至于免疫表型，高NecroScore组中C1、C2和C6比例较高，而C3及C4的更多样本位于低NecroSore组。通过Fisher精确检验，总体分布具有显著性。TCIA证据显示，低NecroScore患者抗CTLA-4阳性或阴性状态的IPS显著降低，对PD-1无反应，表明抗CTLA-4-抑制剂也可能对低分数的阴性PD-1状态患者有影响。此外，作者发现，在低NecroScore组中，一些免疫检查点（如CD274、PDCD1、PDCD1LG2、LAG-3和TMIGD2）下调。有趣的是，低NecroScore组的TIDE评分、MSI和功能障碍评分显著增加。同时，低NecroScore患者的排除分数较低，这表明免疫检查点呈阴性或弱表达的个体也可能证明免疫检查点阻断（ICB）治疗有希望取得结果。 7. 低死亡率组和高死亡率组的突变状态 为了分析LUAD的NecroScore相关机制，对TCGA-LUAD队列的体细胞突变进行了调查。比较两个评分组之间的突变频率，在高NecroScore组中发现更多突变，包括非同义和同义突变。同时，在高NecroScore组中观察到TP53、TTN、PCDH15、LRP1B、ZFHX4、NALCN、CSMD3、MUC16、XIRP2、APOB、PAPPA2、PRDM9、ANK2和LRRC7的突变频率明显较高，而在低NecroScore组中KEAP1的突变频率较高。作者还发现了高突变遗传变异对NecroScore的影响，并发现NecroScore与坏死性相关基因CDKN2A突变频率呈正相关。 8. 药物发现与化疗反应分析 作者分析了坏死性相关分子与LUAD治疗临床疗效之间的关系。根据GDSC的药物反应数据，显示一些基因，如BAHC2、LEF1、DNMT1、TERT、TNFRSF1B、TNFSF10、MPG和ALK与药物具有协同作用，而PANX1、AXL、SLC39A7、TNFRSF21和ID1与药物具有拮抗作用（图7A）。ALK与CH5424802表现出显著的协同作用（阿来替尼、ALK和RET抑制剂，图7A）。同样明显的是，ID1与伏立诺（HDAC抑制剂）、PHA-793887（CDK2抑制剂）、PIK-93（PI4K抑制剂）和SNX-2112（HSP90抑制剂，图7A）等药物的负相关最强。  图7基于坏死性亚型的药物敏感性以及化疗潜力与NecroScore之间的相关性 总结 本研究描述了LUAD肿瘤微环境中坏死性分子的分子和免疫景观。这三种坏死性表型可以区分LUAD的临床特征、免疫浸润和体细胞突变特征。在某种程度上，开发的NecroScore系统可以预测预后和化疗疗效。作者通过多组学方法对单个肿瘤坏死性模式进行综合评估，将加深作者对肿瘤免疫微环境的理解，并制定更有效的免疫治疗策略。 |
|
|
