肝脏负责着身体许多重要的生理过程，包括新陈代谢、解毒和免疫等，其功能的重要性与它结构的复杂性密切相关。肝脏由重复的六边形小叶组成，在这里，一条门静脉（将营养丰富的血液从肠道、脾脏和胃输送到肝脏）、一条肝动脉（将含氧血液从心脏运输到肝脏）和一条由胆管细胞（特殊的上皮细胞）组成的胆管共同构成了一个门静脉三联体，所有进入肝脏的血液随后都会通过肝血窦（一种动态的微血管结构，负责血液和被称为狄氏腔的窦周空间之间的营养交换）从门静脉三联体流向中央静脉（图1）。
肝细胞是肝脏的代谢能量库，位于肝血窦之间，根据它们在肝血窦中的位置负责新陈代谢和解毒的功能，鉴于离中央静脉不同距离处血液含量的差异，这些肝细胞在代谢上是分区的，这意味着它们在小叶内的位置表现出功能异质性。其中巨噬细胞被发现遍布整个肝脏结构，人们曾一度认为肝脏巨噬细胞仅由单一群体的常驻Kupffer细胞（KC）组成，但是单细胞和空间（蛋白质组）基因组学技术彻底改变了人们对细胞异质性的看法，使得人们可以用前所未有的分辨率评估肝脏内巨噬细胞的异质性、它们的特异性标记物和它们的独特位置。KC细胞存在于肝血窦内，是取样和对通过血液进入肝脏的病原体作出反应的最佳位置，与肝窦内皮细胞（LSEC）紧密接触。此外，KC的相当大部分细胞延伸入狄氏腔，与星型细胞和肝细胞密切接触。除KC外，在中央静脉和门静脉三联体中还存在少量的其他巨噬细胞和树突状细胞（图1）。人们如今清楚的知道，即使在稳态下，小鼠和人类的肝脏都有多种的巨噬细胞亚群，而在疾病环境中会招募更多的亚群。
图1
现阶段的这些发现都使得人们开始重新思考巨噬细胞在肝脏稳态和疾病中的作用，然而，目前关于肝脏内巨噬细胞的研究和技术仍存在局限性，从而限制了对其定义、状态和功能的理解，2022年9月13日，来自比利时根特大学的Charlotte L. Scott和Martin Guilliams在Immunity在线发表题为Liver macrophages in health and disease 的观点文章，详细概述了目前已知的不同肝脏巨噬细胞群的定义、可用于识别它们的标记物、它们在肝脏中的整合方式以及它们在健康和疾病中的功能。同时强调了未来待解决的问题，指出跨物种和疾病识别这些细胞内的保守基因特征，无疑将有助于正确识别特定的巨噬细胞亚群，并获得更特异的工具来跟踪和研究这些细胞的功能。
Kupffer细胞，肝脏的常驻巨噬细胞
1876年，KC细胞被发现，20年后被鉴定为巨噬细胞。作为人类已知的最古老的免疫细胞之一，人们对这些细胞的了解仍然相对较少，特别是它们的功能。其中一个原因在于无法将KC与其他肝脏巨噬细胞区分开来看，因为它们都表达包括CD64、F4/80和MerTK在内的通用巨噬细胞标志物。不过近年来，研究人员在这方面取得了相当大的进展。CLEC4F被确认为小鼠KC的特异性标记物，但是它只在KC发育晚期表达，因此很难识别正在发育成KC的细胞，如有疾病的肝脏中单核细胞来源的KC（moKC）的识别。而且CLEC4F在人类中是不保守的，因此目前对真实的人类KC的识别还是缺乏的。此外，小鼠KC上的其他表面受体也被鉴定，使其能够进一步与其他肝脏巨噬细胞区分，包括CLEC2和CD206，其中CLEC2是KC的一个非常早期的标记，在其整个生命周期中持续表达，从而可成为在表达CLEC4F之前识别moKC非常有用的标记。
目前利用单细胞或单核RNA测序 (sc/snRNA-seq) 分析健康肝脏细胞的研究有望揭示人类KC的真实身份，但是现有研究的结果却不尽相同。通过比较人和小鼠，最近提出了KC特异性的核心基因特征，包括CD5L、VSIG4、CD163、FOLR2、MARCO和SLC40A1，可用于在7个不同物种的肝脏中识别KC的单一同质群体。而对现有的不同sc/snRNA-seq数据的“KC特征”进行集合，可以发现一个一致的细胞群，提示其可能成为鉴定KC的有用特征。无论如何，尽管目前需要进一步的研究才能就小鼠和人类肝脏中KC的同质性达成共识，但通过利用KC特异性表面标记物和基因的组合，最终一定可以将KC与其他巨噬细胞区分开来。
健康肝脏中的其他巨噬细胞群
除KC外，肝脏中还存在其他已被确定的巨噬细胞群。其中一类是存在于肝表面下方的肝包膜基质中的肝包膜巨噬细胞（LCM）。在小鼠肝脏中，LCM来源于单核细胞，并在断奶时积累，表达一般的巨噬细胞标志物，但不表达KC标志物。不过在人类中这些细胞的特征仍然未知。虽然LCM在小鼠肝脏中的特征已经比较明确，但它们的转录特征在巨噬细胞中并不是唯一的，因为与存在于中央静脉的巨噬细胞亚群共享。除此之外，在健康小鼠和人类肝脏中还有一类靠近胆管的巨噬细胞亚群，在不同物种间具有相同的转录谱，且与肥胖脂肪组织和脂肪肝中被称为脂质相关巨噬细胞（LAM）的巨噬细胞相似，因此被称为胆管LAM（BD-LAM）。在人类肝脏中，根据CD14、CD11a、CD26、CD141和CD9的表达，可在CITE-seq分析中识别BD-LAM，但在小鼠肝脏中尚缺乏有用的标志物。
由此可见，尽管KC构成了健康肝脏中的主要巨噬细胞群，但它们至少与两种其他巨噬细胞亚群共存。
整合生态位：通过整合和细胞间环路连接KC功能
除了在组织内稳态和免疫监测中作为吞噬细胞的典型作用外，KC还表达许多不参与免疫防御或由其他组织常驻巨噬细胞表达的基因，提示它们可能参与实现肝脏特异性功能，如铁和胆固醇稳态。然而，研究显示在人类肝脏中参与铁和胆固醇稳态的某些关键基因仅由特定细胞表达，表明在整个进化过程中，肝细胞、LSEC、星状细胞和KC共同作为一个整合的生态位发挥作用。这拓宽了巨噬细胞生态位的概念，而不仅仅是生长因子的局部供应。基于此，本文作者提出了一个更模块化的观点——肝血窦由重复的4细胞构建而成，包括KC、星状细胞、LSEC和肝细胞，为了强调每个细胞的功能特性由组合的细胞-细胞环路控制，提出了术语“整合生态位”。转录组特性的紧密交织将确保构成整合生态位的4个细胞之间的分工是正确的、协调的，但这也会限制它们的可塑性。总而言之，整合生态位的强大互联特性对肝脏类器官的发展具有重要影响，因为不同调控程序的遗传整合意味着在这些细胞获得体内功能之前，必须构建包含肝细胞、LSEC、星状细胞和KC的类器官。此外，整合生态位对人们对肝脏疾病的理解也具有重要影响，因为长时间的损伤可能破坏整合生态位，进而可能破坏整个肝脏生态系统的稳定。
病变肝脏中的Kupffer细胞和招募的巨噬细胞
肝脏疾病的一个共同特征是常驻KC群的减少或消失（图2），包括非酒精性脂肪肝（NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、病毒性肝炎、急性肝损伤、细菌感染、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。与稳态条件不同，在NASH或单核细胞增生李斯特菌感染后，常驻KC也无法增殖。有研究认为，KC可通过成为对不同刺激作出反应的可塑性细胞来介导炎症或消退。但是本文作者认为，整合生态位会大大限制KC的可塑性，那么在没有正确区分真正的KC和招募的巨噬细胞的情况下研究肝脏巨噬细胞，KC可塑性的功能可能被大大高估了。因此，在任何情况下，KC的激活方式都是需要回答的问题，值得注意的是，在许多疾病模型中，KC与招募的巨噬细胞被正确地区分，并且观察到了转录程序的改变，这些研究也报告了类似的KC激活谱。除了研究KC是如何被激活的，这种激活与KC参与疾病发病机制的相关性也有待研究。
图2
肝脏疾病也与单核细胞源性巨噬细胞的募集有关，但其命运尚不很清楚。疾病期间不同单核细胞来源的巨噬细胞群的存在引出了两个问题：（1）这些细胞是否在病变肝脏中发挥不同作用，（2）这些巨噬细胞亚群是否代表不同的细胞类型或激活状态。为此，本文作者指出需要首先考虑已知的单核细胞来源的巨噬细胞的不同亚群，如moKC和LAM。研究发现，在NAFLD/NASH和对乙酰氨基酚过量（APAP）这两种截然不同的肝脏疾病模型中，单核细胞已经被证明可以定位于特定的损伤区域并分化为LAM（图2）。在NASH中，这些细胞替代脂肪变性和纤维化区域中死亡的KC，而从较少脂肪变性/纤维化区域丢失的少数KC被moKC替代。除了KC死亡外，在NASH的纤维化模型中还报告了LAM样KC表型，表明在它们死亡之前，KC可能感觉到与浸润LAM相同的信号，导致混合型LAM样KC表型。同样的，在APAP中央静脉受损区域周围也存在类似LAM样KC，此外，LAM也在中央静脉周围发育，可能与活化的成纤维细胞、坏死的肝细胞和其他招募的细胞（如中性粒细胞或cDC）相互作用。由此也表明LAM可通过促进组织修复发挥保护作用。尽管如此，由于缺乏技术工具，目前还是不清楚招募的不同的肝脏巨噬细胞亚群在病变肝脏中的作用。迄今为止收集的有限证据表明，与常驻KC相比，新招募的细胞对损伤的反应不同，再次强调了区分这些群体的重要性。
综上所述，在稳态肝脏中，KC并不是唯一的巨噬细胞群；而在病变肝脏中，还有其他的巨噬细胞群被招募，包括被招募到病变区域的LAM。这种异质性强调了描述这些细胞群的标记物的必要性，并促使该领域重新考量已知的用于区分KC的通用巨噬细胞标记物或工具。总而言之，尽管最近的研究揭示了肝脏巨噬细胞的异质性，但这种理解不可避免地提出了更多的问题。在鉴定了这些细胞群后，下一步目标将是准确区分这些细胞群，以了解它们在健康和疾病方面的独特功能贡献以及调控机制，从而获得特定的功能方案，以改善肝功能、诱导肝再生，有利于患者的健康。
