背景介绍
染色体外DNA（ecDNA）上的癌基因扩增是一种常见事件，会导致肿瘤的侵袭性生长、耐药性和生存期缩短。目前，人们对非染色体癌基因遗传的随机同一性的影响知之甚少，ecDNA对体细胞变异和选择的影响也不清楚。在此，结合随机分离、无偏图像分析、基于CRISPR的ecDNA标记与活细胞成像和CRISPR-C的理论模型，研究人员证明随机ecDNA遗传会导致肿瘤内ecDNA拷贝数的广泛异质性，并能快速适应代谢应激和靶向治疗；ecDNA有助于宿主细胞存活或生长，并可在单个细胞周期内发生变化；通过ecDNA的遗传可以预先预测含有ecDNA的癌症的一些侵袭性特征。ecDNA以染色体癌基因扩增无法实现的方式快速适应基因组的能力促进了这些特性。研究人员在该研究中表明了ecDNA的非染色体随机遗传模式，该项工作发表于Nat Genet1。
文章内容
研究人员首先测试了不同ecDNA扩增的癌基因在细胞分裂后是否随机分离，首先预测有丝分裂后细胞ecDNA含量呈现近似高斯分布（图1a）。研究人员随后开发了一种基于FISH的方法，结合无偏图像分析来量化细胞分裂后子细胞中的ecDNA，使用FISH探针检测这些ecDNA上扩增的癌基因，并使用Aurora B激酶免疫染色来识别有丝分裂后期的子细胞（图1b）。在不同组织的癌细胞系中，研究人员量化了每个细胞系约100对有丝分裂后期子细胞的ecDNA分布，实验结果展示了一个广泛的近似高斯分布，每个子细胞分离的ecDNA比例与随机分离的理论预测高度一致（图1b、c）。研究人员后续设计了一个活细胞成像系统来可视化细胞分裂过程中的ecDNA动力学，在整个细胞周期内跟踪ecDNA（图1d）。活细胞延时成像显示了细胞分裂期间ecDNA的随机遗传模式（图1e），证明了ecDNA在细胞分裂过程中是随机分离的。
图1 ecDNA随机分离到子细胞
研究人员根据观察到的随机分离模式，制定了ecDNA细胞分布的动力学（图2a），两种具有不同的ecDNA的癌细胞系内观察到的ecDNA拷贝数分布也非常广泛，细胞间的极端变异与研究人员模拟预测的分布相匹配（图2b）。在癌症患者的肿瘤切片内的细胞中也观察到相匹配的现象（图2c、d、e），但是，这些观察是间接的和定性的，不能排除随着时间推移平衡选择的作用。
图2 ecDNA的随机分离促进了癌细胞系和患者肿瘤样本中癌基因的瘤内异质性
研究人员使用CRISPR-C在HAP1癌细胞系中生成含有二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的ecDNA（图3a）。CRISPR-C后约15%的细胞含有ecDNA，每个携带ecDNA的细胞只有一个拷贝。因此，能够通过数字液滴PCR来测量ecDNA从一代起是如何随时间演变的。此外，通过生成包含DHFR基因的ecDNA，还能够分别在没有或存在以DHFR为靶点的甲氨蝶呤和中断核苷酸代谢的甲氨喋呤的情况下，对ecDNA进行中性或阳性选择的效果进行建模。由于ecDNA的诱导对细胞不利，ecDNA拷贝最初会丢失（图3b）。在没有甲氨蝶呤的情况下，在最初选择能够耐受和维持ecDNA拷贝的细胞后，平均ecDNA拷贝数保持不变，与模型预测的中性选择一致（图3c）。染色体疤痕频率在整个实验过程中也保持不变，这与中性选择一致（图3d）。相反，研究人员观察到甲氨蝶呤治疗后，ecDNA拷贝数出现了强烈的剂量依赖性上升（图3e），这与不同正选择强度的模拟结果高度一致，并为含有DHFR ecDNA的细胞克服甲氨蝶啶治疗的强选择性优势提供了明确证据（图3f）。为了进一步分析携带癌基因的ecDNA是否处于阳性选择状态，研究人员部署了针对COLO320-DM MYC ecDNA不同基因组区域的导向RNA，以及一个非扩增的第8号染色体的基因间区（图3g）。结果显示，靶向基因间区域的ecDNA，甚至是ecDNA上的MYC，都会导致严重的生长缺陷（图3h）。量化这些细胞中的ecDNA拷贝数时，发现初次感染后第6天ecDNA显著减少（图3i）。综上所述，这些CRISPR-C数据证实了ecDNA和其中包含的癌基因处于强大的选择性压力下，这会影响肿瘤中ecDNA癌基因的平均拷贝数和每个细胞的分布。
图3 癌症中ecDNA的强选择性
研究人员接下来试图证明ecDNA能否比染色体遗传更快速地使肿瘤适应应激（图4a），通过一对来自GBM9患者的等基因细胞系来进行检测。在培养基中只添加20%的葡萄糖后，发现了一个显著的差异，即GBM39-HSR细胞对葡萄糖非常敏感，而GBM39-EC细胞的生长没有明显下降（图4b），GBM39-EC细胞适应葡萄糖的能力表现为每个细胞中含有ecDNAs的EGFRvIII的平均水平和总体分布迅速下降（图4c）。同样的，在添加埃洛替尼后，GBM39-EC通过改变其ecDNA拷贝数来适应变化的条件。在细胞数最初减少后，GBM39-EC细胞在仅仅两周的治疗后对埃洛替尼产生耐药性，改变了其每个细胞的ecDNA分布（图4d、e）。研究人员比较了原发性肿瘤切除术和切除复发两种状况，切除复发在切除前用EGFR酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼治疗7–10天，发现这些患者肿瘤中EGFR平均拷贝数和ecDNA分布显著减少（图4h）。在具有ecDNA扩增MYCNs的NB细胞系TR14和CHP212中，选择拷贝数较低的肿瘤细胞作为长春新碱的反应（图4f、g）。观察到MYCN的平均拷贝数和ecDNA分布都有类似的显著下降，并与细胞系数据相平行（图4i）。总之，这些数据表明了ecDNA实现高水平异质性的清晰模式，提高了对环境或治疗的初始抵抗力。此外，基于ecDNA的癌基因的随机遗传允许通过改变染色体驱动的细胞中不可能的机制实现快速适应、形成耐药性。
图4 随机的ecDNA分离促进快速适应与抵抗葡萄糖戒断和靶向药物治疗
总结与讨论
本文的研究结果表明，ecDNA能通过随机分离和选择增强变异，从而加速肿瘤细胞进化并提高适应性。这些观察结果可以解释靶向致癌扩增事件的治疗在肿瘤中的临床治疗效果有限的原因，为未来治疗此类癌症提供了一种全新的思路。
参考文献
1. Lange, J. T. et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat. Genet. 1–7 (2022) doi:10.1038/s41588-022-01177-x.
