【原】用光诊断心脏异常-利用近红外荧光进行脂肪酸代谢的生物荧光成像-

用光诊断心脏异常-利用近红外荧光进行脂肪酸代谢的生物荧光成像-

 理化学研究所生命功能科学研究中心纳米生物探针研究小组的神隆组长、坪井节子技术人员、北海道大学研究生院尖端生命科学研究院化学生物学研究室的门出健次教授、村井勇太助教、马哈迪巴M. M .斯瓦米助教、 大阪大学研究生院医学系研究科中性脂肪学共同研究讲座的平野贤一任教授(专职)等共同研究小组成功开发出了用于用光可视化心肌中脂肪酸代谢[1]的近红外荧光[2]探针。 本研究成果，作为不使用放射线无创成像心肌中脂肪酸代谢的方法，可以期待对心脏疾病的研究做出贡献。 脂肪酸是心肌的能量来源，其代谢状况反映心脏的状态。 以往在医疗现场，心脏的诊断中使用基于放射性探头123I-BMIPP[3]的心肌脂肪酸代谢的闪烁扫描术[4]。 此次，共同研究小组为了实现使用了可透过身体的近红外荧光的心肌脂肪酸代谢的生物荧光成像[5]，开发了用近红外荧光色素Alexa680[6]修饰的近红外荧光探针“Alexa680-BMPP”代替BMIPP的放射性碘。 通过观测该化合物发出的近红外荧光，确认了人心肌培养细胞和小鼠个体中心肌的脂肪酸代谢可以可视化。本研究被科学杂志《Analyst》的封面采用，于10月7日刊登。

应用近红外荧光探针Alexa680-BMPP对心肌中脂肪酸代谢的生物成像

背景

心脏损害直接关系到生命的危机，因此正确掌握心脏功能的状态在临床上非常重要。 正常的心脏肌肉(心肌)作为能量来源主要利用脂肪酸(长链脂肪酸[7] )，而缺血状态(血液供应不充分的状态)的心肌会利用葡萄糖代替脂肪酸。 因此，无创性心肌长链脂肪酸代谢对于评估心脏功能至关重要，有助于了解健康或疾病的心脏状况。 作为无创地成像心肌中的长链脂肪酸代谢的方法，利用放射性碘( 123I )标记的碘苯基-十五烷酸等长链脂肪酸类似物( 123I-BMIPP )的SPECT (单光子发射计算机断层摄影) [8] SPECT可以实现高灵敏度的心肌代谢成像，但在成本方面存在问题，例如用于检测放射线并成像的大规模诊断设备，以及需要基于放射性物质的标识合成等。 另一方面，作为不使用放射线的无创成像法，有利用红光容易通过身体这一点，使用波长比可见光的红光长的700~900纳米( nm，1nm为10亿分之一米)的近红外光的成像。 在本研究中，将长链脂肪酸与发出近红外荧光的色素结合，尝试了心肌中脂肪酸代谢的近红外生物荧光成像技术的开发。

研究方法和成果。

在设计发出近红外荧光的长链脂肪酸时，我们以作为心肌代谢成像的SPECT探针的BMIPP为基本骨架(图1a、b )。 近红外荧光标识使用了在波长700nm以上进行荧光发光的Alexa680荧光色素。 以这两种分子为材料，合成了具有Alexa680的发近红外荧光的长链脂肪酸“Alexa680-BMPP”代替放射性碘。 作为支链的长链脂肪酸的BMIPP，由于β氧化[1]受到阻碍而难以代谢，具有在心肌中长期停留的性质。 因此，以BMIPP为基本骨架的近红外荧光标记Alexa680-BMPP也有望与BMIPP一样在心肌中用于脂肪酸代谢的成像。 另外，Alexa680-BMPP可以由起始化合物BMIPP通过3个步骤合成，制造也很简单(图1c )。

图1 SPECT探针123I-BMIPP和近红外荧光探针Alexa680-BMPP

• ( a )目前使用的123I-BMIP的分子结构。 ( b )此次开发的Alexa680-BMPP的分子结构。 ( c )以123I-BMIPP为起始物质，通过3步合成Alexa680-BMPP的方法。

开发的Alexa680-BMPP的分子量为1231，分子结构可通过高分辨率质谱[9]、琼脂糖凝胶电泳[10]及荧光光谱的测定进行确认(图2a、b )。 荧光的最大峰值位于近红外波长区域，照射的光(激发光)的能量用于荧光能量的转换效率(量子产率)为39%。 这与一般的近红外荧光色素吲哚青绿的量子产率为1%左右相比，显示出高的荧光亮度。 为了确认Alexa680-BMPP是否作为长链脂肪酸发挥作用，我们研究了培养下进入人心肌细胞的情况。 结果表明，与对照色素(未与脂肪酸结合的Alexa680 )相比，Alexa680-BMPP能明显进入心肌细胞(图2c )。 这表明Alexa680-BMPP具有荧光长链脂肪酸的功能。

图2用作荧光长链脂肪酸的Alexa680-BMPP

• ( a ) Alexa680-BMPP和Alexa680 (对照色素)的琼脂糖凝胶电泳。 分子量大的Alexa680-BMPP泳动缓慢。 ( b ) Alexa680-BMPP和Alexa680显示出基本相同的荧光光谱，荧光的最大峰在近红外波长区域。 ( c )细胞荧光图谱，显示Alexa680-BMPP和Alexa680掺入人心肌细胞差异。 红色荧光显示细胞摄取的Alexa680-BMPP，蓝色荧光显示细胞核。 如右图所示，Alexa680不进入人心肌细胞。

(接着，为了确认脂肪酸代谢能否在活小鼠的心肌进行荧光成像，向无发小鼠[11](4周龄，Hos:HR-1 )经尾静脉注入Alexa680-BMPP，观测了近红外荧光(图330 ) 小鼠心脏部位近红外荧光强度在注入Alexa680-BMPP后30分钟达到最大，随时间其荧光强度逐渐减小(图3b、c )。 作为对照，尾静脉给予了等量的Alexa680，但几乎没有观察到荧光(图3b、c )。 另外，从注入荧光色素后切除的心脏组织的荧光成像图像中发现，Alexa680-BMPP与Alexa680相比，吸收量为5~6倍(图3d )。 这些实验结果表明，Alexa680-BMPP作为荧光长链脂肪酸，进入小鼠心肌。

图3应用3 Alexa680-BMPP对无发小鼠心肌脂肪酸代谢成像

• ( a )无发鼠明视野影像。 虚线方形部分表示观测到荧光的胸部区域。 ( b ) Alexa680-BMPP和Alexa680分别经尾静脉注入无发小鼠后拍摄的近红外荧光图像。 小鼠心脏部位近红外荧光强度在注入Alexa680-BMPP后30分钟达到最大，随时间其荧光强度逐渐减小。 图4 ( c )是表示在图4 ( b )中拍摄的荧光图像的荧光强度的时间变化的图。 ( d ) Alexa680-BMPP和Alexa680注入无发小鼠后30分钟切除的心脏组织近红外荧光图像。

接下来，我们研究了Alexa680-BMPP向心肌的摄取是否会根据心肌的生理状态而变化。 人们普遍知道，长期绝食小鼠，会增强脂肪酸向心脏的摄取。 因此，我们对绝食24小时的老鼠和为了比较用普通饲料饲养的老鼠的心脏组织进行了近红外荧光成像。 结果，在生物荧光成像(图4a、b )和分离切除的心脏的荧光图像(图4c、d )的任一个中，绝食的小鼠明显大于喂食的小鼠向心脏的摄取 以上结果显示，荧光性长链脂肪酸Alexa680-BMPP作为可观测心肌生理状态的荧光探针发挥作用。

图4反映心肌生理状态的Alexa680-BMPP的荧光强度

• ( a ) 24小时绝食及喂养小鼠心脏区域近红外生物荧光成像。 图像是在静脉注射Alexa680-BMPP分钟后拍摄的。 ( b )绝食及喂食小鼠(各5只)心脏区域荧光强度。 绝食小鼠的荧光强度显著高于喂食小鼠( *p<0.05，n=5)。 ( c ) 24小时绝食及喂养小鼠(各5只)切除的心脏组织近红外荧光显像。 图片是在静脉注射Alexa680-BMPP分钟后拍摄的。 ( d )绝食及喂食小鼠切除的心脏组织荧光强度。 绝食小鼠的荧光强度显著高于喂食小鼠( *p<0.001，n=5)。

  
  

今后的期待

迄今为止，尚未开发出用于无创测量心肌脂肪酸代谢的荧光长链脂肪酸。 此次，是世界上率先成功合成的发出近红外荧光的长链脂肪酸( Alexa680-BMPP )，使心肌中脂肪酸代谢的荧光成像成为可能。 由此，能够更简便地对只能通过SPECT等放射线成像进行检查的心肌的脂肪酸代谢进行成像。 这种使用近红外荧光的心肌成像技术有望应用于各种心脏疾病研究。

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補足説明

• 脂肪酸代谢、β氧化 心肌作为能源，主要利用脂肪酸和葡萄糖。 在供氧良好的健康心肌中，空腹时约80%的能源使用脂肪酸β氧化。 β氧化是由脂肪酸生成乙酰辅酶a的代谢反应。 2 .近红外荧光 近红外是指波长比可见光长的区域，是指波长700~900nm的光。 近红外荧光是指近红外的荧光。 3.123I-BMIPP β位置带有甲基的侧链脂肪酸。 用放射性同位素碘标记对心肌脂肪酸代谢成像，用作心肌闪烁扫描放射性造影剂。 123I-BMIPP是123 I -β- methyl-p-iodophenyl-pentadecanoic acid的缩写。 4 .闪烁扫描 一种检查方法，是通过静脉注射或胶囊服用放射性药品，用专用装置从体外测量从进入体内的部分释放出的伽马射线，将药物分布图像化。 5 .生物荧光成像 无创可视化生物体内部的技术。 迄今为止实用化的方法有x射线CT (计算机断层摄影)、MRI (磁共振断层摄影)、PET (正电子发射断层摄影)等。 在利用荧光的生物成像中，利用组织透过性好的近红外和短波红外荧光将生物内部可视化。 6.Alexa680 菁类荧光色素。 显示出比以往的荧光色素更强的荧光强度，光稳定性也优异。 有从蓝到红的色调种类，也适用于多色检测。 通用于核酸、抗体、蛋白质等荧光标签。 Alexa680的色素在680nm附近具有最大吸收，在700nm以上的近红外区域进行荧光发光。 7 .长链脂肪酸 脂肪酸是指长链烃的一元羧酸，根据碳原子数与短链中链脂肪酸相区别。 长链脂肪酸是指碳原子数为11~22的脂肪酸。 8.SPECT (单光子发射计算机断层扫描) 在闪烁扫描术的应用中，检测体内给药的放射性同位素释放的伽马射线，将其分布制成断层图像的方法。 给药主要通过静脉注射进行。 可以取得脑血流、骨、心肌等断层图像。 SPECT是single photon emission computed tomography的缩写。 9 .质谱分析 将分子离子化，使获得的离子在高真空中加速，在电场和磁场中移动，根据各离子种类的质量差异进行分离检测的分析。 可以得到化合物的分子量、分子式等相关信息。 10 .琼脂糖凝胶电泳 这是一种使用琼脂主要成分琼脂糖的电泳，根据其分子大小、电荷等分离核酸、蛋白质、脂质等的方法。 11 .无发小鼠 由于没有普通毛的形成和伸长，所以不需要脱毛，是适合生物荧光成像的老鼠。 与裸鼠不同，免疫功能正常。