许多疾病与细胞膜受体介导的信号转导通路异常相关,目前大多数靶向细胞膜受体的疗法是通过抑制配体结合或者抑制酶活性来实现的。但是哺乳动物蛋白具有多个不同功能的结构域,抑制单个结构域常常不能完全抑制一个蛋白的功能。因此,科学家开发了靶向蛋白降解的技术,如蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs),来直接降解靶向的蛋白。但是PROTACs的渗透性、药代动力学和药效较差【1】,因此,科学家需要开发新的更有效的方法来降解细胞膜受体蛋白。近日,来自美国Genentech的Felipe de Sousa e Melo和Nicholas J. Agard研究团队在Nature上发表题为Antibody targeting of E3 ubiquitin ligases for receptor degradation的文章,开发了一种蛋白降解靶向抗体(PROTABs),可以将细胞表面的E3泛素连接酶和跨膜蛋白连接起来,导致蛋白降解,通过利用响应Wnt的泛素连接酶ZNRF3,这种方法可以实现结直肠癌中靶蛋白特异性降解。为了利用细胞内在的降解机制来进行基于抗体靶向的蛋白降解,研究人员在一系列细胞表面的E3泛素连接酶中将目光投到了RNF43和ZNRF3上。RNF43和ZNRF3是Wnt信号转导的负调控因子,促进Wnt受体FZD/LRPs的降解。他们首先检测了在APC基因突变激活Wnt信号通路,模拟结直肠癌的小肠类器官中,RNF43和ZNRF3的表达量增加,而在正常小肠中,RNF43仅仅只在干细胞所在的隐窝表达。他们猜测RNF43和ZNRF3可以被利用来选择性降解结直肠癌细胞中的蛋白,于是他们首先检测了RNF43和ZNRF3是否可以用来降解一个经典的靶点,胰岛素生长因子1受体(IGF1R)。他们将二聚化结构域DmrA和DmrC分别融合在RNF43/ZNRF3和IGF1R上,添加一种二聚化化学诱导剂,发现可以诱导RNF43/ZNRF3和IGF1R结合。进一步,他们构建了一种双特异性抗体,将靶向IGF1R的已知的7种抗体之一与靶向糖蛋白D(gD)的抗体结合,他们将这种抗体称为PROTABs,在表达gD-RN43或gD-ZNRF3的细胞中添加PROTABs,可以诱导IGF1R从细胞表面被降解。为了将这种方法拓展到可以利用内源泛素连接酶,他们找到了可以靶向内源RNF43和ZNRF3的抗体,将这些抗体与IGF1R的抗体Cixu结合,发现这样得到的PROTABs可以通过内源的RNF43和ZNRF3导致IGF1R的降解。拿到了IGR1R PROTABs之后,研究人员评估了他们的生物学活性。他们首先评估了PROTABs和配体竞争性抗体对于IGF1R下游活性的影响,发现PROTABs可以更显著地抑制IGF下游AKT和S6的磷酸化。第二步,他们检测了PROTABs的生物有效性和细胞渗透性,发现对抑制了SW48肿瘤的小鼠进行单次静脉注射就可以导致IGF1R的大量降解,并且降解只发生在肿瘤细胞中,而不发生在正常的结肠黏膜细胞中。然后,他们利用人类结肠类器官进行检测,发现PROTABs特异性降解结肠癌患者来源的结肠类器官中的IGF1R,而几乎不降解正常结肠类器官中的IGF1R。因此,ZNRF3*IGF1R PROTABs具有结肠癌肿瘤选择性。ZNRF3*IGF1R PROTABs具有结肠癌肿瘤选择性接下来,为了研究背后的机制,他们首先分析了实验细胞系中ZNRF3和IGF1R的拷贝数,发现在IGF1R:ZNRF3大于400:1的细胞系中仍然能观察到有效的降解,提示这是由催化活性介导的。他们进一步敲除了ZNRF3的N端结构域或RING结构域,发现都可以抑制IGF1R降解。而且,用小分子抑制E1泛素激活酶也可以抑制IGF1R降解;PROTAB可以直接导致IGF1R泛素化,因此PROTAB通过诱导ZNRF3介导的IGF1R泛素化促进其降解。为了证明PROTAB的普遍适用性,他们靶向了其他的膜蛋白HER2和PD-L1,发现PROTAB也可以导致其他膜蛋白(如HER2和PD-L1)的降解。接下来,研究人员想知道PROTAB是否也可以使用其他的细胞表面E3泛素连接酶。在449个已知的E3泛素连接酶中,他们鉴定了一些位于细胞表面E3泛素连接酶,发现这些其他的E3泛素连接酶也可以用于PROTAB降解细胞膜蛋白(如IGF1R、HER2、PD-L1和FZD5)。下一步,他们想通过蛋白质工程来加强降解效率,他们首先发现用2+1Fab-IgGs的形式,结合两个拷贝的IGF1R对降解效率的影响不大,而结合两个拷贝的连接酶可以加强降解效率,但是它也降低了细胞表面RNF43的量(可能诱导了反式自磷酸化)。接着他们检测了单臂Fv-IgG的形式,发现IGF1R-RNF43Fv-IgG可以导致更高的降解效率。因此,通过对抗体亲和力、形式和表位的优化可以促进靶蛋白的有效降解。总的来说,这项研究开发了一种新的方法PROTAB,通过细胞表面的E3泛素连接酶实现抗体诱导的跨膜蛋白泛素化和降解,并且PROTAB可以实现在肿瘤中特异性降解跨膜蛋白。PROTABs可以广泛应用于跨膜受体和细胞表面E3泛素连接酶,使得组织特异性靶向跨膜蛋白降解成为可能,未来将这一方法与抗体工程相结合,可以为进一步的基础研究和临床疗法的开发提供新的工具。 原文链接: https://www./articles/s41586-022-05235-6 1. Goracci, L. et al. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs): The Next Step toward Pharmaceutical Applications. J. Med. Chem. 63, 11615–11638 (2020).
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