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小组介绍 小组：旱伞草下好乘凉 组员：朱宛莹 白新明 欧祥卉 贾剑铭 卢俊洁 郑雨露    左右滑动查看更多 Q：你们在了解无融合生殖的课题时有遇到什么困难吗？你们怎么克服的呢？ A：大家都觉得读文献最难的还是翻译。比如神秘的“蛋细胞”（egg cells），其实就是我们熟悉的卵细胞，“沃肥”（Fertilization）实际上是受精。书读百遍，其意自现，解决方法就是反复捉摸，读多了就会克服语言障碍，一点点解开完全不能理解的文字，最终发现，复杂的线团里面，其实藏着简单而清楚的逻辑。 Q: 你们有什么收获和感想吗？ 当然，我们对科学研究的基本方法，严谨逻辑，和创新态度都有了更深刻的认识。无融合生殖非常有趣，它听起来像个美好的童话，知道自然界中其实有很多这样的现象后，又会觉得这也没那么难。但深入了解了科学家们如何通过一点一点艰苦的探索，才揭开了这条有性和无性生殖之间的神秘通路时，就会明白这是一项解民生之多艰的伟大研究，而真正的研究者，会将论文写在祖国的大地上。我们也应该更多的了解实际，将研究变得脚踏实地，而不是飘在天上。 01 背景介绍 俗话说民以食为天，回顾农业发展的历史，第一次绿色革命通过将作物的高秆变矮秆，解决了19个发展中国家粮食自给问题。而我们今天的主角“无融合生殖技术”的研究被科学家称为一场无性的革命，它的影响将远超第一次绿色革命开创一个新的纪元。  图一 杂种优势示意图 我们都知道杂交品种具有优良性状，但性状不能稳定遗传。制种工作是特别繁重的，中国水稻研究所研究员王克剑曾说：“对于育种家而言，制种非常辛苦，它不仅要讲究郎才女貌、门当户对，还要讲究性格相投、优势互补。这些还不行，还要讲究在合适的时间、合适的地点，遇到合适的人。”也就是说制种存在着品种选育难，杂交制种难，种子成本高的三大难题。  图二 王克剑（左）在观察水稻生长情况 为了解决这个问题，我们发明了籼型三系杂交水稻，又研发出两系杂交水稻技术，育种专家还没有满足，他们绞尽脑汁要实现一种植物自然繁殖，产生的种子却是母体遗传物质的精确遗传复制品。这就要依靠无融合生殖技术。  图三 双受精过程和无融合生殖过程示意图 无融合生殖是是一种不常发生、但在植物界普遍存在的生殖现象。在植物界存在的有性生殖、无性生殖和无融合生殖三大系统中，无融合生殖是最缺乏研究而又有特殊价值的一种。 无融合生殖是不经过精卵结合而产生种子的一种生殖方式，获得的后代与母本植物完全一致，是母本植物的克隆，可随世代更迭而不改变基因型，性状也不发生分离，因此无融合生殖可用于杂种优势的固定。 实现无融合生殖的基本思路是实现减数分裂向有丝分裂转变和配子不受精的独立发育。 今天我们小组就来分享一下 围绕这几个步骤逐渐实现 无融合生殖的几个有趣的研究 02 MiMe品系 首先，我们需要了解一下MiMe品系，MiMe（mitosis instead of meiosis）指有丝分裂代替减数分裂，MiMe品系的形成是对减数分裂区别有丝分裂的3个关键点同时破坏，即把同源染色体之间配对和重组、第一次减数分裂时姐妹染色单体不分离、一次DNA复制后发生两次分裂3个点同时突变，使减数分裂过程类似于有丝分裂，产生的配子保留了母本所有的遗传信息，从而完成无融合生殖三要素中最关键的无融合减数分裂过程，现在已成为无融合生殖的有力“工具”之一。拟南芥是最早成功构建MiMe的物种，通过spo11-1、rec8和osd1三基因突变构建拟的南芥MIME，是重要的无融合生殖模型。  图四 拟南芥MiMe品系突变的基因的作用 MIME株系产生的克隆配子的自受精会产生倍性加倍的后代。如图四所示，在随后的的几代中，MiMe的倍性在每一代翻倍，从（A）2n（10条染色体）到（B）4n（20条染色体）到（C）8n（40条染色体），左侧为有丝分裂中期染色体行为图，右侧为相应的4周龄植物和花朵。  图五 MiMe品系的传代倍性加倍 03 解决染色体加倍的途径之一  要获得正常的无融合生殖种子，还必须解决染色体加倍的问题。2011年，Raphaël Mercier团队在Science上发表的题为“Synthetic clonal reproduction through seeds”的文章就试图解决这个问题。该研究发现了一种染色体消除突变体系GEM，GEM的配子形成合子后会将自己的染色体消解掉，从而实现只保留MiMe的染色体，从而实现阻止染色体的加倍。  图六 （A）左：正常繁殖 中：无融合生殖 右：克隆体与GEM杂交示意图（B、C）亲本和杂交后代多态性基因座基因分型的结果 实验结果分析得到，MiMe品系作为母本和GEM系杂交制得的种子后代当中的二倍体中，有98%的植株保留MIME株系的杂合性。而且第一代得到的克隆MiMe和Gem杂交后代性状也得到了保持，证明通过MIME获得多代无融合种子是可行的。虽然上述所描述的系统仍依赖于杂交，且存在一些问题，但为无融合生殖的发展提供了新思路。  图七 实验部分结果分析 04 MiMe品系在水稻中的应用 有了模型是不够的，只有用进粮食作物才能实现价值。接下来这篇16年Mieulet Delphine团队发表在cell resreach的题为“Turning rice meiosis into mitosis”文章就尝试将模型运用在水稻中。整个研究分为三部分，首先，它扩展了可以突变以创建MiMe表型的基因目录，然后通过生物信息学的方法定位出水稻中关键OSD1基因的同源物，并制作水稻该基因突变体完成了验证。最后通过制种和验证，团队发现了水稻中pair1，rec8和osd1突变的组合，和mime品系具有相同的效果，因此，将该品系称为OsMiMe。实现了在水稻中产生克隆雌性二倍体配子。 图八 pair1，rec8，osd1突变的水稻减数分裂 05 BBM1基因启动胚的发育 那么如何启动无融合生殖途径得到的水稻种子的胚发育的问题呢？ 2018年美国加州大学戴维斯分校Sundaresan研究组发表在Nature的题为“A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds”的论文发现，在水稻中，有一个叫做Baby Boom的基因家族。 他们将其中的BBM1和GFP捆绑表达，结果如图9-a所示，发现只有BBM1来自父本，才在受精卵核观察到GFP表达，也就是BBM1只在精子里表达。且BBM1卵细胞表达胚珠中胚乳未发育，如图9-b。 图九 受精卵中BBM1的父系表达 a. 红色箭头指向受精卵核 b.黑色箭头指向胚乳位置 实验团队敏锐地指出，BBM1有可能是启动胚胎发育的“开关”。为了测试这个想法，他们用crisperkis9技术敲除了BBM1，BBM2，以及BBM3，果然水稻胚胎发育异常(如图10-a)。而在这三重突变体里引入BBM1基因，胚胎发育过程又会被重新恢复（如图10-b）。 图十 bbm1 bbm2 bbm3突变胚胎的表型和 单倍体诱导 原来，原本雌配子中的bbm1是休眠的，当精子中的bbm1表达时，会激活雌配子中的bbm1，共同调节胚胎发育。 图十一 BBM1在水稻胚胎发生中的作用示意图 也就是说在MiMe品系卵细胞中再异位表达BBM1，就可以诱导水稻孤雌生殖，团队也对此做了验证，成功培育出了健康稳定的二倍体。由于在其他谷类作物中也发现了同源BBM样和MiMe基因，因此本文所述的方法或许可扩展到大多数谷类作物。 图十二 验证实验中MiMe + BBM1-ee品系的表征 这篇文章的作者之一Venkatesan Sundaresan曾说：“我们有一个双倍体的卵细胞，它能形成胚胎，长成一个克隆体。”很好的概括了他们的成就。 06 Fix突变体途径 让我们骄傲的是， 2019年1月4日，Nature Biotechnology发表了来自中国农科院王克剑课题组的题为“Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes”的研究论文，他们也发现了一种最终实现无融合生殖的机制。 该课题分为三个部分。首先是验证mime的可行性。同样通过CRISPR-Cas9 制备osMIME品系，图1-b中的荧光染色体的两个信号即表明MiMe确实减数异常分裂。但发现其后代倍性增加时，可育性大幅下降。 图十三 探索MiMe技术在杂交水稻品种中 的可行性 第二步就是解决染色体逐代倍增的问题。有资料显示MTL基因可以触发单倍体诱导，该课题就试图据此诱导mime形成单倍体。流式细胞术显示，实验制备的MTL突变体中，这些植物中有九个确实是单倍体，而两个是二倍体，均为纯和。而这两个二倍体也可能是由于单倍体胚胎自发加倍而产生的。研究表明，双倍单倍体植物显示出正常的营养和穗生长。 图十四 诱导单倍体的探索 第三步就是结合上述技术，完成无融合生殖的过程。图十五-a左侧表示同时使用了上述技术的异常减数分裂过程。先通过MiMe技术使杂交植株生成二倍体配子，又通过MTL基因编辑来使父本基因组消失。这和我们介绍的第一项研究异曲同工，似乎揭示着科学研究的环环相扣。 图十五 Fix突变体实验验证 最终得到的Fix突变体既保持了杂交水稻品种的杂交优势，又避免了自我受精时的倍性增加，基本实现了无融合生殖。虽然实验中，用于诱导父系基因组消除的MTL基因对杂种生育力有负面影响，仍需探索提高Fix突变体生育力的方法，但已经是非常激动人心的成就了。 07 “蒲公英”的思路 ——PAR基因的发现 MiMe品系的路线告一段落 最后让我们来看看最近新在蒲公英中发现的 一条路线 自然界中其实有很多能够无融合生殖的植物，等着我们去发掘其中的机制。蒲公英就是非常理想的无融合生殖研究材料。多倍体蒲公英能够给二倍体有性植物体传粉。例如其二倍体材料可以接收四倍体的花粉，形成符合无融合生殖特点的三倍体材料。 图片十六 蒲公英的生殖特例 作者以三倍体无融合生殖材料A68为研究对象，通过伽马射线照射了2650个单株，以寻找缺失无融合生殖LOP（LOSS OF PARTHENOGENESIS）表型的种子。他们发现野生型种子的头部是黑色的，而LOP表型种子的头部则不是黑色，前者的胚胎处于发育过程中而后者卵细胞发育停滞（如图十七）。研究种根据这个区别寻找缺失无融合生殖LOP品系的种子。 图十七 LOP品系的区别 接着，他们对LOP品系进行探究，利用BAC文库和nanopore测序构建了其PAR区段的完整图谱，总共发现有3个单倍型，其中一个单倍型与其他两个差异较大，是显性无融合生殖单倍型。 图十八 PAR位点和LD结构特征分析 通过标记辅助选择再次将区间缩小，并利用CRISPR–Cas9技术对该区间范围内的13个候选基因都进行基因敲除，发现只有一个基因A_g295的突变体与之前LOP的表型一致，并且A_g295基因的突变体不能进行孤雌生殖，只有授粉才能结实，因此认定A_g295基因就是控制孤雌生殖的PAR基因。 图十九 通过CRISPR-Cas9诱变鉴定PAR基因 作者在山柳菊里也发现了类似基因，验证实验又证明该模型对生菜也适用。而生菜是菊科的重要蔬菜，包括叶用的生菜和茎用的莴笋，而杂交生菜过于昂贵，所以生菜一般是自交繁殖。因此，在生菜中引入无融合生殖，可以使有活力的杂交品种被开发和繁殖，具有极大的经济价值。 图二十 山柳菊和生菜中的验证 结语 随着一代又一代育种专家们的努力，无融合生殖的研究已经取得了重大的进展。当然，仍然有很多的谜团尚未破解，很多的问题没有解决，比如无融合生殖对子代有哪些不良影响，如何提高子代的成活率与结实率，比如其它经济作物中是否还能找到新的无融合生殖途径。 总之，想真正实现从“1”到“∞”多，我们还有很长的路要走。 参考文献： [1] Calzada, Jean-Philippe, V, et al. Apomixis: The asexual revolution.[J]. Science, 1996. [2] 侯艳红,龚桂芝,彭祝春,董倩倩,罗艾,洪棋斌.MIME——有丝分裂替代减数分裂及其在作物无融合生殖中的应用[J].生物工程学报,2020,36(04):612-621.DOI:10.13345/j.cjb.190225. [3] d'Erfurth Isabelle,Jolivet Sylvie,Froger Nicole,Catrice Olivier,Novatchkova Maria,Mercier Raphaël. Turning meiosis into mitosis.[J]. PLoS biology,2009,7(6). [4] Mohan P. A. Marimuthu,Sylvie Jolivet,Maruthachalam Ravi,Lucie Pereira,Jayeshkumar N. Davda,Laurence Cromer,Lili Wang,Fabien Nogué,Simon W. L. Chan,Imran Siddiqi,Raphaël Mercier. Synthetic Clonal Reproduction Through Seeds[J]. Science,2011,331(6019). [5] Mieulet Delphine,Jolivet Sylvie,Rivard Maud,Cromer Laurence,Vernet Aurore,Mayonove Pauline,Pereira Lucie,Droc Gaëtan,Courtois Brigitte,Guiderdoni Emmanuel,Mercier Raphael. Turning rice meiosis into mitosis.[J]. Cell research,2016,26(11). [6]Khanday Imtiyaz,Skinner Debra,Yang Bing,Mercier Raphael,Sundaresan Venkatesan. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds.[J]. Nature,2019,565(7737). [7]. Biotechnology; New Biotechnology Findings from China National Rice Research Institute Outlined (Clonal Seeds From Hybrid Rice By Simultaneous Genome Engineering of Meiosis and Fertilization Genes)[J]. Biotech Week,2019. [8]Underwood Charles J,Vijverberg Kitty,Rigola Diana,Okamoto Shunsuke,Oplaat Carla,Camp Rik H M Op den,Radoeva Tatyana,Schauer Stephen E,Fierens Joke,Jansen Kim,Mansveld Sandra,Busscher Marco,Xiong Wei,Datema Erwin,Nijbroek Koen,Blom EvertJan,Bicknell Ross,Catanach Andrew,Erasmuson Sylvia,Winefield Christopher,van Tunen Arjen J,Prins Marcel,Schranz M Eric,van Dijk Peter J. A PARTHENOGENESIS allele from apomictic dandelion can induce egg cell division without fertilization in lettuce.[J]. Nature genetics,2022,54(1). 文字/朱宛莹 全组人员 图片/网络 编辑/张怡芊 |
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