雷公藤治疗系统性红斑狼疮的免疫作用机制研究

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种以慢性炎症和免疫异常为特征的复杂自身免疫性疾病，累及多个器官，临床表现多样，如淋巴细胞减少、肾损伤、胸膜炎、脑膜炎、角膜炎及胃肠道症状等[1-2]。目前临床常用的治疗西医药物为糖皮质激素和免疫抑制剂，但往往带来较为严重的不良反应[3-4]。现代中医学认为SLE属于热毒炽盛证[5]，而大多数传统中医药具有低毒高效的特点，不良反应较轻，这也为其在治疗SLE的临床应用中带来新思路。

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.是卫矛科雷公藤植物的根、叶及花，性凉，具有消炎、解毒的功效。研究表明，雷公藤具有明确的抗炎作用，雷公藤制剂也具有免疫抑制、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，对于治疗SLE具有很大的潜能[6-8]。本研究采用网络药理学联合加权基因共表达网络分析（WGCNA）方法探讨雷公藤作用于SLE的相关分子机制，为治疗SLE提供理论依据。

流程图

本研究的分析流程图见图1。

雷公藤活性成分及其靶点的筛选

在TCMSP数据库中以OB≥30%、DL≥0.18为条件共筛选出50个雷公藤活性成分，见表1。通过SwissTargetPrediction、HERB数据库检索这些活性成分的相关靶点，合并去重后共得到了690个相关靶标。

疾病靶点基因差异分析与WGCNA分析

利用R软件的limma包进行数据集的差异分析，共得到1 338个差异基因，其中上调基因532个，下调基因806个，结果用火山图展示（图2A）。在WGCNA分析中，使用软阈值8和最小模块值为30来定义邻接矩阵（图2B），图2C展示了通过基因邻接系数层次聚类构建的基因树状图，通过模块基因与性状关联分析，发现4个与发病密切相关的模块基因（MEblue、MEgrey、MEturquoise、MEbrown）共1 215个基因（图2D）。

交集靶点Meta分析与相关性分析

将690个药物靶点和1 215个模块基因导入R软件中，利用VennDiagram包进行交集分析，获得交集靶点基因48个，即雷公藤治疗SLE的潜在作用靶点（图3A）。为探究交集靶点基因是否稳定表达，基于20个SLE相关的GEO数据集，对交集靶点基因在SLE的表达情况进行Meta分析（图3B）。结果显示，48个交集靶点基因在多个SLE数据集中均较稳定的上调或下调表达。图3C展示了48个靶点基因的相关性。

富集分析

将48个基因导入R软件，利用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析，根据P＜0.05分别筛选出1 245个BP条目、45个CC条目和136个MF条目。前30个GO条目见图4。

BP主要富集在中性粒细胞活化（neutrophil activation）、脂多糖反应（response to lipopolysaccharide）、非生物刺激反应（cellular response to abiotic stimulus）、环境刺激反应（cellular response to environmental stimulus）、细菌源性反应（response to molecule of bacterial origin）等；CC主要富集在质膜外侧（external side of plasma membrane）、囊泡腔（vesicle lumen）、分泌颗粒膜（secretory granule membrane）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、细胞质囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）；MF主要富集在细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、磷酸酯水解酶活性（phosphoric ester hydrolase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、磷酸酶活性（phosphatase activity）、肽结合（peptide binding）。

同样根据P＜0.05筛选出91条KEGG富集条目，前10通路的气泡图见图4。这些通路主要富集在脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）、甲型流感（influenza A）、人类巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、沙门氏菌感染（salmonella infection）等。

“药物–活性成分–靶点”和PPI网络构建

用Cytoscape软件处理得到雷公藤“药物–成分–靶点”相互作用关系网络（图5A）。其中共包括72个节点，125条边，靶基因节点48个，活性成分节点23个。

利用CytoNCA插件进行度值分析发现雷公藤中度值大于6的活性成分为山柰酚（kaempferol，degree＝18）、雷公藤甲素（triptolide，degree＝9）、triptofordin B1（degree＝9）、异落叶松脂素[(2R,3R,4S)-4-(
4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-methoxy-2,3-imethylol-tetralin-6-ol或isolariciresinol，degree＝9]、南蛇藤β-呋喃甲酸胺（celafurine，degree＝7）、异黄腐酚（isoxanthohumol，degree＝7）、雷公藤内酯酮（triptonide，degree＝7）、过氧麦角甾醇（peroxyergosterol，degree＝7）。

将48个互作靶点导入STRING网络平台，PPI网络有71个节点，206条边，下载网络文件导入Cytoscape进行可视化调整，PPI网络和cytoHubba 4种算法的可视化见图5B。

核心靶点基因筛选与分析

将4种算法获取到的前10靶点基因的交集作为核心靶点基因，得到了核心靶点基因SIRT1（图6A）。将SIRT1导入STRING网络平台，PPI网络有11个节点，41条边，下载网络文件导入Cytoscape进行可视化调整（图6B）。通过R软件提取SIRT1基因表达量数据，SIRT1在正常和SLE中的表达情况见图6C，SIRT1诊断ROC的曲线下面积达到0.758（图6D），提示SIRT1可能作为疾病诊断的潜在指标。综上，SIRT1在是雷公藤治疗SLE的核心靶点，相对于正常样本在SLE中呈低表达，具有一定的临床诊断价值。

分子对接

将雷公藤筛选得到的核心靶点与其所对应的关键蛋白使用AutoDock Vina软件进行分子对接验证，以直观的方式展示了关键成分的最佳构型和核心靶点之间的相互作用。其中SIRT1蛋白与山柰酚、雷公藤甲素、triptofordin B1、异落叶松脂素的对接结合能均小于−5 kJ/mol，结合能分别为−37.2 kJ/mol、−25.5 kJ/mol、−25.52 kJ/mol和−24.27 kJ/mol，对接模拟可视化见图7。雷公藤中的主要活性成分与核心靶点的高结合亲和力表明，雷公藤可能是通过调节以上相关靶标发挥治疗SLE的作用。

免疫浸润分析

利用表达量数据，通过CIBERSORT算法进行SLE免疫微环境分析，绘制了正常样本和患者22种免疫细胞比例分布图（图8A）。正常样本和SLE患者的22种免疫细胞差异情况见图8C，结果显示B cells naive、T cells CD8、T cells CD4 naive、T cells CD4 memory resting、T cells CD4 memory activated、Tregs、T cells gamma delta、NK cells resting、macrophages M0、dendritic cells activated、mast cells activated、neutrophils在患病前后的数量变化具有显著差异，提示SLE的发生于发展可能与这些免疫细胞失调有关。

提取SLE患者表达数据，并根据SIRT1表达进行高低分组，结果发现SIRT1的高低表达与T cells CD8、T cells CD4 memory resting、Tregs、NK cells resting、monocytes、macrophages M0、mast cells resting、mast cells activated、neutrophils的细胞数量显著相关（图8D），其中趋势最为明显为T cells CD4 memory resting和neutrophils。在对SIRT1与免疫细胞的相关性分析发现，与SIRT1最相关的免疫细胞是neutrophils（图8B）。这表明SIRT1可能通过下调neutrophils数量进而缓解SLE的进程。

讨论

本研究结合生物信息学与药物网络分析的方法，探讨具有作用多靶点、多通路的复杂中药雷公藤与SLE的关系[19]。基于“药物–成分–靶点”网络，发现雷公藤抗SLE的主要活性成分为山柰酚、雷公藤甲素、triptofordin B1和异落叶松脂素。山柰酚是许多蔬菜和水果中发现的天然黄酮类化合物。流行病学研究已经描述了山柰酚摄入量可以降低肺、胃、胰腺和卵巢癌等癌症的风险。使用山柰酚对预防和治疗炎性疾病如系统性红斑狼疮，类风湿关节炎和强直性脊柱炎有治疗效果[20]。

雷公藤甲素已被广泛报道用于治疗多种炎症性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、牛皮癣等，其抗炎安全性和有效性已经被许多研究证实。Zhao等[21]发现，雷公藤甲素可以通过介导Treg上调诱导miR-125a-5p从而改善狼疮。雷公藤甲素还可以通过抑制JAK/STAT信号通路激活缓解SLE模型小鼠炎症免疫反应[22]。最近的研究表明，雷公藤甲素治疗SLE的机制可能与其调节Tc与Th细胞向Tcl和Tc2漂移，维持治疗不同阶段Tc与Th细胞相对稳态而影响免疫应答及炎症反应过程有关[23]。triptofordin B1和异落叶松脂素在SLE中的研究较少，这可能为SLE的药物治疗提供新思路。

通过cytoHubba插件中MCC、MNC、DMNC、Degree 4种算法得到雷公藤治疗SLE中最核心靶点Sirtuin 1（SIRT1）。SIRT1是Sirtuin蛋白家族的一员，它的产生依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的II型组蛋白脱乙酰酶和单ADP核糖基转移酶。SIRT1广泛参与机体的各种生理和病理过程，包括代谢、衰老、转录、DNA损伤和修复、凋亡、细胞周期调控、炎症和癌症[24-25]。同时SITR1可能是免疫系统中的一个重要调节元件，其功能的改变可能与SLE的发展有关[26]。

B淋巴细胞过度活动是系统性狼疮红斑的主要特征，SIRT1过表达可以促进BAF3细胞增殖，抑制细胞凋亡和上调促炎细胞因子[27]。尿液中SITR1的表达变化也与狼疮肾炎（LN）患者的疾病活动性密切相关[28]。研究报道雷公藤中多种活性成分均对SIRT1有抑制作用，雷公藤内酯醇可通过激活SIRT1/PGC-1alpha和SIRT1/NF-κB信号通路改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍[29-30]。山奈酚也可通过激活SIRT1和抑制PARP1抑制过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞炎症和凋亡[31]。

在对交集靶点通路分析的结果中，本研究发现了一个重要的通路：Toll样受体信号通路。SLE患者B细胞和T细胞对自身抗原的免疫耐受丧失是由Toll样受体（TLRs）以细胞内在方式控制的[32]。研究发现，TLR7激动剂咪喹莫特可以通过抑制辅助性T淋巴细胞的分化，阻止MRL/lpr小鼠SLE的进展[33]。双氢青蒿素可以抑制狼疮小鼠脾细胞中Toll样受体4信号通路的活化[34]。Toll样受体信号通路是本研究富集到的主要通路，这提示雷公藤可能通过抑制Toll样受体信号通路来调节B细胞和T细胞的增殖与分化，发挥抗SLE的作用。

综上，雷公藤通过多成分、多靶点、多通路来治疗SLE，其中核心的成分、靶点和通路分别为山柰酚和雷公藤甲素、SIRT1、Toll样受体信号通路。为雷公藤治疗SLE的研究提供了新的思路与理论基础，但后续仍需进一步的实验验证。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：孟祥文，贾晓益，陆志远，程芷洛，谭亚楠，张敏．基于网络药理学联合加权基因共表达网络分析探究雷公藤治疗系统性红斑狼疮的免疫作用机制 [J]. 现代药物与临床, 2022, 37(10): 2215-2225 .