第1章 发酵工程第2节微生物的培养技术及应用第2课时微生物的选择培养和计数[学习目标] 1.明确选择培养基对微生物进行选择的原理。2.学会、
选择分离微生物及统计微生物数量的方法。3.能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。知识自主梳理生存环境水生栖热菌绝大多数
微生物水生栖热菌目的菌温度抑制或阻止选择培养基特定抑制或阻止脲酶 氮源 稀释涂布平板庞大充分稀释选择109019涂布器酒精火焰上3
0～37 1～2 滴尽 过热的涂布器 稀释度足够高一个活菌菌落数30～3003平均值少菌落菌落数活菌数显微镜直接计数细菌计数板或血
细胞计数显微镜活菌数和死菌数的总和菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同。血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉
菌孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。脲酶 尿素 碳源氮源凝固剂3～8 中1×103～1×107 30～
300 菌落数目稳定时 灭菌 做好标记 平板上培养样品的稀释度 (5)分解尿素的细菌的进一步鉴定①鉴定原理细菌合成的脲酶将尿素分解
成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，可通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应是否发生。②鉴定方法在以尿素为唯一氮源的培
养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 能在选择培养基上生长
的一定是目的菌吗？提示：不一定。原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生
物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。 进行恒温
培养时为什么要将培养皿倒置？提示：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成的水滴在培养基表面更
好地挥发；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌体随水扩散，很难再形成单菌落，达不
到分离目的。 实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理？提示：所有接触过细菌的器皿都要先灭菌后再洗涤；使用后的废弃物(
特别是培养基)也要灭菌后再抛弃。 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？提示：测定土
壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同。 菌落计数时，除了采用稀释涂布平板法和显微镜直接
计数法外，还可以采用什么方法？举例说明。提示：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例：将已知体积的水过
滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的
数量。课堂小结笔记空间 ____________________________________________________
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学习目标检测1．(目标1)土壤中能分解尿素的细菌，是因为它们能合成( )A．尿素酶 B．脲酶C．蛋白酶 D．肽酶
解析 能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用，B正确。2．(目标2)分解尿素的微生物广泛存在
于农田等土壤中，下列关于对分解尿素的微生物进行分离和计数的操作正确的是( )A．配制培养基时应选择包括尿素在内的多种物质作为氮源
B．用于分离能分解尿素的细菌的培养基中应提供与培养硝化细菌等细菌相同的碳源C．在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间作为
对照，目的是检测培养基是否合格D．计数时，在同一稀释度下，任取3个平板对其中的菌落数进行统计，取其均值即可解析 分解尿素的微生物能
合成脲酶，配制分解尿素的培养基时应以尿素作为唯一氮源，A错误；能分解尿素的细菌是异养型生物，培养该生物所需碳源为有机碳源，而硝化细
菌属于自养型生物，其所需碳源为无机碳源，B错误；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合
格，若灭菌后的空白平板培养一段时间后没有菌落生长，说明培养基平板灭菌合格，C正确；为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的
平板进行计数，D错误。3．(目标2)用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是
( )A．平板上的一个菌落就是一个细菌B．菌落中的细菌数是固定的C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D．此方法统计
的菌落数一定与活菌的实际数相同解析 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，当样品的稀释度足够高时，平板上的一个菌落一般来源于样品
稀释液中的一个活菌。4．(多选)(目标2)稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述正确的是( )A．操作中
需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落D
．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理解析 若菌液浓度过大，形成的菌落连在一起，得不到单个的菌落，C错误。5．(目标3
)某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计单位体积内的活菌数目。按照培养基的配方称取，并将各种物质溶解后，用蒸馏水定容、灭菌，制
成固体培养基备用。回答问题：(1)在配制培养基时，需加入________作为唯一的氮源，该培养基从功能上看属于________培养
基，配制好的培养基应用____________________法灭菌。(2)培养分解尿素的细菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染
。对于固体培养基应采用的检测方法是__________________________________ _____________
____________________________________。尿素 选择 高压蒸汽(或湿热)灭菌 (3)若要统计土壤样
品中尿素分解菌的数目，宜采用______________法接种，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目就能
大约推测出样品中的活菌数。一同学在稀释倍数为1×104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为51.2，则每毫升样品中的活菌数是(所用
稀释液的体积为0.2 mL)_______________。(4)实验中使用过的培养基及其培养物必须经过________处理后才能
丢弃，以防止微生物的扩散。解析 (1)要分离土壤中能分解尿素的细菌，在配制培养基时，需加入尿素作为唯一的氮源，由于该培养基能将分解
尿素的细菌选择出来，因此该培养基从功能上看属于选择培养基，培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法(或湿热灭菌法)。稀释涂布平板 2.56
×106个 灭菌 (2)要检测固体培养基是否被污染，应将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，若有
菌落产生则说明该培养基已经被污染，否则没有被污染。(3)要统计土壤样品中尿素分解菌的数目，宜采用稀释涂布平板法接种。若一同学在稀释
倍数为1×104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为51.2，所用稀释液的体积为0.2 mL，则每毫升样品中的活菌数是51.2÷0
.2×104＝2.56×106 (个)。重点题型突破题型一 选择培养基的选择作用[例1] 在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生
长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生
物群体中分离出( )A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌B．固氮细菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌C．固氮细菌、霉菌、酵母菌D．固氮细
菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌解题分析 固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚
的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制真菌的生长，酵母菌属于真菌。选择培养微生物的两种方法(1)可利用分离对象对某一营养物质
有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。(2)可利用分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物
中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可大量增殖，在数量上占优势。题型二 正确区分平板划线法和稀释涂布平板
法[例2] (多选)下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，据图分析正确的是( )A．获得图A效果的接种方法是
稀释涂布平板法B．获得图B效果的接种方法是平板划线法C．若在纯化土壤细菌时菌液浓度过高，培养基上的菌落可能会连成一片D．在接种前要
对培养基进行消毒处理解题分析 在接种前要对培养基进行高压蒸汽灭菌处理，D错误。比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同点题型三 分解尿
素的细菌的分离与计数[例3] 如表为培养某种微生物的培养基配方，请回答有关问题：(1)该培养基只允许分解尿素的细菌生长，这种培养基
称为________培养基。该培养基会抑制其他种类微生物生长，其原因是该培养基_________ ________________
__________________________________________。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自
培养基中的__________和__________，实验需要振荡培养，原因是________________________。选
择 以尿素 为唯一的氮源，不能利用尿素的细菌不能在该培养基上生长 尿素 葡萄糖 为“目的菌”提供氧气 (3)若要通过统计培养基中菌
落数来估计样品中的细菌数，上述培养基中还需要添加的成分是________，接种时应采用________________法。(4)某
同学用0.1 mL稀释液在稀释倍数为106的平板中测得菌落数的平均值为163，则每毫升样品中的细菌数是_____________。
解题分析 (1)该培养基以尿素为唯一氮源，只允许分解尿素的细菌生长，不能利用尿素的细菌不能在该培养基上生长，这种培养基叫作选择培养
基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型生物，所以在培养过程中需振荡。(4
)某同学用0.1 mL稀释液在稀释倍数为106的平板中测得菌落数的平均值为163，则每毫升样品中的细菌数为163÷0.1×106＝
1.63×109(个)。琼脂 稀释涂布平板 1.63×109个 课后课时作业[单项选择题] 知识点一 选择培养基1．发酵
工程的第一个重要工作是选择优良的单一纯种。消灭杂菌，获得纯种的方法不包括( )A．根据微生物对碳源需要的差别，使用不同碳源的培养
基B．根据微生物对O2需要的差别，在培养微生物时提供有氧、无氧条件C．根据微生物遗传组成的差异，在培养基中加入不同比例的核酸D．根
据微生物对抗生素敏感性的差异，在培养基中加入不同的抗生素解析 不同的微生物对碳源、氮源、O2、pH的需求不同，可以根据微生物的生长
需求来配制特殊的培养基以获得单一纯种，也可以根据其对抗生素的敏感性不同，加入不同的抗生素来获得单一纯种。每种微生物在生长繁殖过程中
都能合成核酸，在培养基中加入核酸，不能起到选择作用。2．在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，下列不属
于厌氧细菌生存环境的是( )A．土壤深层 B．人或动物肠道内寄生C．真空 D．池塘淤泥解析 土壤深层环境含氧量较低
，厌氧细菌可以生存，A正确；人或动物肠道内是一个较为缺氧的环境，厌氧细菌可以生存，B正确；真空环境下，由于细胞内外具有压强差，厌氧
细胞会因压强差较大而爆裂，无法生存，C错误；池塘淤泥是一个缺氧环境，厌氧细菌可以生存，D正确。 知识点二 微生物的选择培
养3．现有菌液10 mL，按下图进行系列稀释，在最后一个试管中测得细菌数为20个，则未稀释前的试管中有细菌( )A．600个
B．1200个 C．2×107个 D．2×106个解析 从本题的图中可看出，每次都是稀释1×10倍，总共稀释6次，即最后一
个试管中稀释1×106倍，最后一个试管为20个，即原来菌液中应该有细菌2×107个，C正确。A．步骤①取土壤样品灭菌后溶于无菌水
中制成菌悬液B．步骤②的固体平板可以
是以脂肪为唯一碳源的培养基C．步骤②射线照射可引起细菌基因突变或染色体变异D．步骤③透明圈越大的菌落，其脂肪酶活性一定越高4．产脂
肪酶细菌可用于含油废水处理。科研人员用射线照射从土壤中分离的菌株，反复筛选后获得产酶能力提高的菌株，具体流程如图。相关叙述正确的是
( )解析 土壤样品中包含目的菌株，进行灭菌会杀死所有微生物包括要培养的目的菌株，所以不可以进行灭菌处理，A错误；要筛选可以产生
脂肪酶的细菌，需要用以脂肪作为唯一碳源的固体培养基，B正确；细菌是原核生物，没有成形的细胞核和染色体，因此用射线照射不会引起细菌染
色体变异，C错误；透明圈的大小是由菌种分泌的酶量与酶活性共同决定的，透明圈大的菌落，酶活性不一定大，因此对初筛选的透明圈大的菌落要
进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活性检测，D错误。5．下列关于微生物接种的描述，正确的是( )A．平板划线法只用于固体培养基的
接种，而稀释涂布平板法只用于液体培养基的接种B．平板划线法的操作相对简单一些C．利用平板划线法不能得到单菌落，而利用稀释涂布平板法
能得到单菌落D．平板划线法所用的接种工具不需要灭菌，而稀释涂布平板法所用的接种工具需要灭菌解析 这两种方法都用于固体培养基的接种，
都能形成单菌落，接种工具都要进行严格灭菌处理。A．为保障无菌环境，需要在倒平板后再次进行灭菌处理B．倒平板后直接培养观察有无菌落出
现，可判断培养基有无被污染C．因为嗜热菌在添加了乙、丙生长因子的区域之间生长，故该菌生长需要生长因子乙和丙D．不同的菌种所需的生长
因子不同，利用生长图形法可筛选某些菌种6．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组
把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加
到不同区域，培养结果如图所示。下列说法错误的是( ) 知识点三 微生物的数量测定7．关于土壤取样的叙述，错误的是(
)A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B．先铲去表层土，在3～8 cm深处取样C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D．应在火焰
旁称取土壤解析 土壤取样要注意无菌操作，取样用的小铁铲和信封在使用前需灭菌，C错误。8．测定分解尿素的细菌时，在对应稀释倍数为1×
106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是( )A．一个平板，统计的菌落数是230B．两个平板，统计的菌落数是2
20和260，取平均值240C．三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D．四个平板，统计的菌落数分别是2
10、260、240和250，取平均值240解析 为保证结果准确，选择菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，应至少对
3个平板进行重复计数，然后求出平均值。9．关于土壤中细菌的分离，下列正确的操作步骤是( )①土壤取样 ②称取10 g土壤，加入盛
有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL进行平板涂布 ④依次稀释至1×103、1×104、1×105、1×106、1×10
7倍A．①→②→③→④ B．①→③→②→④C．①→②→④→③ D．①→④→②→③解析 在分离土壤中某种细菌时，应先选取土样
(10 g)，然后加入到盛有无菌水的锥形瓶中获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，C正确。[多
项选择题]10．关于微生物的计数方法说法正确的是( )A．常用的计数方法有稀释涂布平板法、平板划线法、血细胞计数法B．显微镜直接
计数法统计的结果是活菌的数目C．用血细胞计数板或细菌计数板计数的方法属于显微镜直接计数法D．稀释涂布平板法计数值一般比真实值偏低解
析 统计微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法，A错误；显微镜直接计数法统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，B错
误。11．用稀释涂布平板法来统计样品中尿素分解菌的数目，为了提高实验结果的可信度，往往要设置对照实验，对于对照组的要求包括( )
A．对照组培养基也严格灭菌，且不接种任何微生物B．倒平板时，培养基的用量与实验组必须完全相同C．所用培养基成分及pH大小与实验组保
持一致D．对照组和实验组均放在相同且适宜的条件下培养解析 对照组培养基也要严格灭菌，且不接种任何微生物，为空白对照，A正确；对照组
培养基用量的大小与实验组基本相同即可，不一定绝对相同，B错误；对照组所用培养基的成分及pH应与实验组完全一致，C正确；对照组和实验
组的培养基都要置于相同条件下培养，以保证单一变量，D正确。[非选择题]12．土壤是“微生物的天然培养基”，下面是有关土壤中分解尿素
的细菌分离、鉴定和计数的实验过程，请据图回答相关问题：(1)能分解尿素的细菌代谢类型为____________，为获得该种细菌，应
从富含有机质的土壤表层取土样。(2)为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用__________________的培养基进行分离。异养
需氧型以尿素为唯一氮源(3)因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前，一定要____
____以减少误差。将1× 103 ～1×107倍的稀释液分别吸取0.1 mL加入到固体培养基上，用________将菌液铺平，这
种接种方法称为________________。为鉴别出分解尿素的细菌培养基中还应加入________指示剂。(4)将接种的培养皿
放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察并统计具有___________(现象)的菌落数，结果如下表，其中_______
________倍的稀释比较合适。摇匀涂布器稀释涂布平板法酚红红色环带 1×105和1×106 解析 (4)分解尿素的细菌能合成脲
酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，酚红指示剂将变红，将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，具有红色环
带的菌落即是分解尿素的细菌的菌落。估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30到300之间的平板，分析表格数据可知，1×105和1×
106的稀释度下菌落数在这一范围。13．临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一
定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用__________法或_________ ______法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。(2)取该单菌落适当稀释，用______________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。平板划线 稀释涂布平板稀释涂布平板 (3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B______；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明______________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________。(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素______。解析 (2)为了使该致病菌均匀布满平板，需要将获取的致病菌单菌落，经过适当稀释，用稀释涂布平板法接种至固体培养基表面，并进一步培养。敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比对A的弱 耐药菌 A 本课结束 |
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