分类号 密级 U D C 编号 硕士学位论文创伤性脑损伤后GMFB对星形胶质细胞极性的影响及机制研究The mechanism
of GMFB on astrocyte polarity after traumatic brain injury 陈镕骅导师姓
名吴炳义专业名称神经病学培养类型专业型硕士论文提交日期南方医科大学2019级硕士学位论文创伤性脑损伤后GMFB对星形胶质细胞极性的
影响及机制的研究The effcets of GMFB on astrocyte polarity after traumatic
brain injury课题来源：国家自然科学基金（81771340）学位申请人陈镕骅导师姓名吴炳义专业名称神经病学培养类型专业
型硕士培养层次硕士研究生所在学院第一临床医学院答辩委员会主席答辩委员会成员 年 月 日 广州摘 要背景：创伤性脑损伤(
Traumatic brain injury,TBI)具有高的发病率、致残率和死亡率等。哺乳动物的神经再生能力有限，一旦遭遇损伤会
给大多数患者造成永久的神经功能障碍。目前关于创伤性脑损伤的治疗方法是有限的。TBI后中枢神经系统(Central nervous
system，CNS)的反应涉及多种细胞类型，其中星形胶质细胞是参与中枢神经系统损伤后的关键细胞。它会参与形成胶质瘢痕，这一过程中
星形胶质细胞会发生极性改变，保证其能准确迁移到损伤部位。而胶质瘢痕的作用历来被认为是一把双刃剑。胶质成熟因子-β（Glial ma
turation factor-β，GMFB）在细胞中参与细胞骨架的调控，主要通过与Arp2/3结合来调控细胞骨架的去分支。在生理
情况下，GMFB在脑组织中低表达，但在病理情况下，GMFB在脑皮质中的表达升高。研究证明GMFB的表达与胶质细胞激活有关。但关于G
MFB在创伤性脑损伤后中星形胶质细胞极性改变的作用及机制目前尚不清楚。目的：本研究拟探讨创伤性脑损伤后GMFB在星形胶质细胞极性改
变中的作用及机制。方法：主要是采用改良的自由落体法在C57BL/6及Gmfb敲除小鼠上建立创伤性脑损伤模型。（1）Western
blot检测对照组及创伤性脑损伤后1天、3天、5天脑皮质中GMFB、GFAP表达水平；免疫荧光检测星形胶质细胞中GFAP和GMFB
的表达情况。（2）PCR、Western blot、免疫荧光对Gmfb的敲除进行鉴定。（3）将对照组及损伤后3天小鼠脑组织进行GF
AP免疫荧光染色，共聚焦获取多层扫描图像，使用FiJi软件进行Sholl分析，量化星形胶质细胞复杂性。（4）GFAP免疫荧光染色后
观察星形胶质细胞极性。（5）原代星形胶质细胞根据先前报道的方法进行改良提取培养，并使用鬼笔环肽对其进行细胞骨架染色；使用鬼笔环肽对
拉春库林B解聚处理后的细胞染色，通过计算细胞面积比较解聚速率；通过划痕实验观察野生型及Gmfb敲除星形胶质细胞迁移的差异及特点。结
果：（1）创伤性脑损伤后GMFB先于GFAP表达升高，在GFAP阳性星形胶质细胞中可以检测到GMFB的表达。（2）生理情况下,敲除
Gmfb后小鼠大脑解剖结构与野生型小鼠的无明显差异，星形胶质细胞形态也未见明显差异；敲除Gmfb可以逆转创伤性脑损伤后3天星形胶质
细胞靠近胞体的细胞突起分叉数目减少的改变。（3）敲除Gmfb使创伤性脑损伤后5天的星形胶质细胞缺失极性；（4）敲除Gmfb使星形胶
质细胞中Arp2/3排列无规则，细胞骨架形态短小，排列紊乱，细胞骨架的解聚速率加快，细胞迁移速率增快，迁移过程中缺乏方向性。结论：
敲除Gmfb后创伤性脑损伤引发的星形胶质细胞缺失极性，存活神经元增多，其初步机理为：关键词：创伤性脑损伤；胶质成熟因子-β；星形胶
质细；细胞极性；细胞骨架；肌动蛋白相关蛋白2/3ABSTRACTBackground：Traumatic brain injury
(TBI) has high morbidity, disability and mortality rate. Mammali
ans have limited nerve regeneration capacity, and encountering in
juries can cause permanent neurological dysfunction in most patie
nts.. Current treatments for TBI are limited.. The Central nervou
s system (CNS) response after TBI involves a variety of cell type
s, with astrocytes being the key cells involved in the CNS injury
..It is involved in the formation of glial scar, during which ast
rocytes are polarity to ensure accurate migration to the site of
injury.. The role of glial scar has always been considered a doub
le-edged sword. Glial maturation factor-β (GMFB) is involved in t
he regulation of the cytoskeleton in cells, and mainly regulates
its debranching by binding to Arp2 / 3.. In physiological cases,
GMFB is poorly expressed in the brain tissue, but is elevated in
the cerebral cortex in pathological cases. It was demonstrated th
at GMFB expression is associated with glial cell activation.Howev
er, the role and mechanism of astrocyte polarity alteration of GM
FB after TBI are still unclear.Objective：This study intends to ex
plore the role and mechanism of GMFB in astrocyte polarity change
s after traumatic brain injury.Methods: The TBI model was perform
ed using a modified weight-drop model previously described by Fli
erl.Western blot was tested for GMFB and GFAP expression levels i
n control subjects and cerebral cortex at 1,3, and 5 days after t
raumatic brain injury, and GFAP and GMFB expression in astrocytes
by immunofluorescence.(2)Knockdown of Gmfb was identified by PCR
, Western blot, and immunofluorescence.GFAP immunofluorescence st
aining was performed on control and mouse brain tissue 3 days aft
er injury, confocal acquisition for multilayer scanning images, a
nd using FiJi to quantify astrocyte complexity by Sholl analysis
.(4)Astrocyte polarity was observed after immunofluorescence stai
ning for Gf A P.Primary astrocytes were extracted and cultured as
described previously reported and stained for cytoskeleton; Cell
s were stained after depolymerization treatment with latrunculin
B using phalloidin to compare the depolymerization rate by calcul
ating the cell area; and observed the differences and characteris
tics of wild-type and Gmfb knockout astrocytes through scratch ex
periments.Results：(1) GMFB expression increases before GFAP after
TBI, and GMFB expression can be detected in GFAP-positive astroc
ytes.(2) Physiologically, there was no significant difference bet
ween Gmfb brain anatomy and wild-type mice, and no astrocyte morp
hology; Gmfb knockout could reverse the decrease in cell process
fork number of astrocytes near the cell body at 3 days after TBI.
(3) Knockdown of Gmfb removes the polarity of astrocytes at 5 day
s after traumatic brain injury;(4) Knockdown of Gmfb causes an ir
regular Arp2 / 3 arrangement in astrocytes, a short cytoskeleton
morphology, a disordered arrangement, an accelerated depolymeriza
tion rate of the cytoskeleton, a faster cell migration rate, and
a lack of directionality in the migration process.KEYWORDS:Trauma
tic brain injury; GMFB; Astrocyte; Cell-polarity; Cytoskeleton；Ar
p2/3目 录摘要ⅠABSTRACT1第1章 前言11.1创伤性脑损伤11.2 星形胶质细胞11.3 胶质成熟因子-β（G
lia mature factor beta,GMFB）2第2章 GMFB在创伤性脑损伤后大脑皮质星形胶质细胞中表达升高52.1
实验材料52.1.1 实验动物52.1.2 实验器材52.1.3 主要实验试剂62.2 实验方法72.2.1 小鼠创
伤性脑损伤模型的建立72.2.2 脑组织取材固定及冰冻标本的制备82.2.3 免疫荧光82.2.4 Western blot
检测92.2.5 使用的软件及分析方法142.3 实验结果142.3.1 创伤性脑损伤后脑组织中GMFB表达水平先于GFAP
升高142.3.2 创伤性脑损伤后脑组织中GFAP阳性星形胶质细胞中有GMFB的表达162.4 结果分析18第3章 敲除Gm
fb使创伤性脑损伤后星形胶质细胞复杂性升高193.1 实验材料193.1.1 实验动物193.1.2 实验器材193.1.3
主要实验试剂203.2 实验方法223.2.1 鼠尾基因鉴定223.2.2 小鼠创伤性脑损伤模型的建立253.2.3
脑组织取材固定及标本制备253.2.4 免疫荧光263.2.5 尼氏染色（Nissl染色）273.2.6 Western b
lot检测283.2.7 sholl分析及数据统计283.3 实验结果283.3.1 Gmfb敲除的验证283.3.2 敲
除Gmfb后小鼠脑的解剖结构未见明显异常293.3.3 敲除Gmfb可逆转创伤性脑损伤后星形胶质细胞复杂性降低的改变303.4
结果分析34第4章 GMFB促进胶质瘢痕形成过程中星形胶质细胞的极性改变354.1 实验材料354.1.1 实验动物354
.1.2 实验器材354.1.3 主要实验试剂354.2 实验方法364.2.1 脑组织取材固定及标本制备364.2.2
免疫荧光364.3 实验结果374.3.1 GMFB增强星形胶质细胞极性374.3.2 敲除Gmfb使损伤后神经元存活数目
增多384.4 结果分析40第5章 GMFB与Arp2/3结合调控星形胶质细胞的细胞骨架排列方式415.1 实验材料415.
1.1 实验细胞415.1.2 实验器材415.1.3 主要实验试剂425.2 实验方法425.2.1 原代星形胶质细胞
的提取培养425.2.2 细胞的鬼笔环肽染色435.2.3 细胞免疫荧光445.2.4 划痕实验445.2.5 拉春库林实
验455.2.6 使用的软件及分析方法455.3 实验结果465.3.1 敲除Gmfb使星形胶质细胞中Arp2/3排列无规则
465.3.2 GMFB调控细胞骨架排列结构485.3.3 敲除Gmfb使体外划痕实验中星形胶质细胞的迁移速度增快525.4
结果分析55第6章 全文总结与讨论58参考文献61致谢65南方医科大学学位论文原创性声明67第1章 前言1.1创伤性脑损伤创
伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)多是由于外部机械作用（如坠落、交通事故、暴力等）冲击人体头部而造
成的，随着现代科技的进步，这种损伤的发生逐年增高，除了较高的发病率，它还有较高的致残率和死亡率等特点，在各个年龄段皆可发生[1-4
]。不同于表皮、骨组织、肝脏等身体其他大多数部位的损伤在发生损伤后很大程度上能再生，哺乳动物的中枢神经系统在损伤后缺乏再生的能力，
因此一旦遭遇损伤会给大多数患者造成永久的神经功能障碍或躯体残疾, 这大大降低了个人生活质量，同时给家庭、给社会带来了沉重的负担，也
成为全球重大公共卫生问题，亟待解决[5-7]。虽然创伤性脑损伤的发生率在逐渐升高，但由于神经系统本身的特殊性及复杂性，目前关于创伤
性脑损伤的治疗手段及措施仍是有限的，这就产生了一个日益增高的发病率同治疗措施匮乏的矛盾。因此不断研究、探索、寻找更有效、更合理的治
疗创伤性脑损伤的治疗方法显得尤为重要。在目前的研究当中，除了聚焦于神经元本身的损伤、损伤后的修复之外，也有部分研究将重心放在参与神
经元损伤及修复的其他环节中。其中就有研究表明，TBI后中枢神经系统(Central nervous system, CNS)的反应
涉及多种神经和非神经细胞类型，星形胶质细胞是参与中枢神经系统损伤后的关键细胞[8, 9]，在既往神经系统其他类型的损伤中认为它如同
一把双刃剑，关于它在损伤中的作用一直有争议，一方面它在损伤发生后会限制损伤的扩散，同时也可能对损伤修复过程中神经元的再生产生抑制作
用[8, 10-16]。我们课题组便以此切入点深入研究创伤性脑损伤的病理改变,为寻找新的靶向治疗方法以及改善患者预后提供新的理论依
据。1.2 星形胶质细胞星形胶质细胞是CNS中一种特殊而重要的胶质细胞类型，其数量是神经元的5倍多。它几乎遍布整个大脑中，连接整
个中枢神经系统。起初人们对星形胶质细胞的并不深入，随着神经科学的发展，人们对它在中枢神经系统中发挥着的作用有了进一步的探索和发现[
14-20]。在健康的中枢神经系统中，星形胶质细胞并不只是发挥简单的连接整个大脑的作用，它还发挥许多重要而复杂的功能，如为中枢神经
系统中神经元供能，调控神经系统的离子和代谢平衡,以及参与突触的新生、成熟和修剪，以及能量代谢和信息传递等[21-23]。除了在生理
情况下它发挥着重要作用，在中枢神经系统各类损伤发生后的病理情况下，星形胶质细胞参与的环节也不容忽视。在以往许多研究中提到，星形胶质
细胞在包括创伤性脑损伤等多种病理情况下会发生如细胞肥大、GFAP表达增加、极性改变、迁移、增殖和瘢痕形成等许多病理改变以应答损伤，
这一个过程称为星形胶质细胞的活化[8, 10, 11, 14, 24, 25]。而关于星形胶质细胞的活化对损伤后神经损伤修复所带来
的效应一直褒贬不一。有研究强调星形胶质细胞胶质化过程中神经胶质瘢痕的形成抑制了轴突的再生，且过度的星形胶质细胞激活会使星形胶质细胞
释放大量炎症因子，进而影响神经功能的恢复。但也有许多研究指出反应性星形胶质细胞活化和活化后瘢痕形成在神经保护和再生方面有许多有益效
应，如在损伤的初期，星形胶质细胞通过胶质瘢痕的产生，在损伤组织与健康组织之间形成一个栅栏样的瘢痕界限，从而发挥限制炎症的扩散、促进
血脑屏障的修复、减少神经元损伤等效应[8-11, 15, 25]。由此，我们不难看出星形胶质细胞活化后瘢痕修复是中枢神经系统损伤后
发生的重要病理生理环节，如果能寻找到它的发生机制，在此基础上对这一过程进行合理调控，更大程度的去扩大它在中枢神经系统中发挥的积极效
应，这对创伤性脑损伤的治疗无疑是一个重要的突破点。1.3 胶质成熟因子-β（Glia mature factor beta,GM
FB）胶质细胞成熟因子(Glia mature factor，GMF)在1972年从牛脑中分离出来，被认为是一种生长分化因子，是由
胶质成熟因子-β（Glia mature factor beta，GMFB）和GMF-γ两种化合物组成的混合物[26]。在生理条件
下，GMFB在大脑、胸腺、肾脏、肝脏等组织中都有表达[27-29]，但主要是在中枢神经系统中，尤其在胶质细胞和神经元中表达，被认为
是神经元和胶质细胞的生长和分化因子[30, 31]。在斑马鱼胚胎器官发育形成的过程中,GMFB一直是持续高表达水平的，在器官发育成
熟后，生理状态下GMFB仅维持较低的表达水平[32]。在一些研究中也提到Gmfb敲除对小鼠来说并不是致死性的，只在进行一些复杂活动
的学习时，敲除Gmfb会使小鼠表现出一定程度的缺陷[33, 34]。这些都提示相对于维持生命的作用，GMFB更多的是使机体应对和适
应应激环境。目前有报道称，在许多神经炎症、损伤和诸如帕金森、阿兹海默症等神经退行性病变中，GMFB的表达会出现再次上调，同时还会伴
随出现星形胶质细胞的激活，并且在阿兹海默症模型小鼠中发现敲除Gmfb会使星形胶质细胞的激活减弱[35-43]。基于这些研究我们认为
GMFB可参与到中枢神经系统遭遇创伤性脑损伤后的应答过程中，而它参与损伤的方式很可能是通过调节星形胶质细胞的活动来实现。我们课题组
前期初步证实了GMFB促进斑马鱼创伤性脑损伤后的反应性胶质细胞活化的多个过程，如GFAP的肥大、放射状胶质细胞（radial gl
ia cell，RGC）的增殖、激活等[44]。因此我们更有理由认为在创伤性脑损伤后GMFB参与调节了星形胶质细胞对损伤的应答。而
关于GMFB是如何调控损伤后星形胶质细胞的应答过程的，目前尚无明确定论。既往研究报道GMFB在细胞生命活动中参与了细胞骨架去分支的
活动，是一个重要的细胞骨架去分支调节因子。这一过程主要是通过与肌动蛋白相关蛋白Arp2/3结合(图1-1)，在纤维状肌动蛋白细胞骨
架的分支处将分支剪切下来，从而达到一个减少细胞骨架分支形成的作用[45-47]。另外，GMFB与许多炎症激活通路相关，在一些疾病模
型中GMFB被认为可通过介导炎症因子的释放而促进星形胶质细胞激活，星形胶质细胞的激活后又会促进炎症因子的释放，从而起到炎症放大的作
用[40, 43]。图1-1 GMFB调节细胞骨架去分支示意图[45]众所周知，细胞骨架是细胞在执行生命活动时的载体，一切生命活
动均需要在细胞骨架的支撑下完成。因此基于上述研究现状及基础，我们认为创伤性脑损伤后GMFB很有可能是通过对细胞骨架的调控进而对星形
胶质细胞的损伤应答过程进行调节。本研究拟在既往研究基础上，初步探讨创伤性脑损伤后GMFB在星形胶质细胞参与损伤应答过程中发挥的作用
及其相关机制。为寻找创伤性脑损伤后新的靶向治疗方法以及改善患者预后提供新的理论依据，同时也为其他类型神经系统损伤后的治疗策略提供线
索。第2章 GMFB在创伤性脑损伤后大脑皮质星形胶质细胞中的表达升高2.1 实验材料2.1.1 实验动物6-8周的C57BL
/6雄性小鼠，均从广东省实验动物中心购入。2.1.2 实验器材名称 公司产地自由落体脑损伤模型击打器安徽正华生物 中国低温离心机
Eppendorf公 德国1.5mL离心管（EP管）Axygen公司 美国组织研磨仪 上海净信公司 中国酶标仪 Bio Tek公司
美国Western blot转印电泳仪 Bio-Rad公司美国化学发光仪 宝特科技 中国冰冻切片机 徕卡（Leica） 德国冰
冻切片机适配刀片 徕卡（Leica） 德国湿盒凯圳中国24孔板 康宁 美国96孔板 康宁 美国水平摇床 Orbital公司 德国
LSM980共聚焦显微镜 蔡司 德国精密电子秤 赛多利斯公司 德国小鼠恒温垫 耀坤 中国37℃细胞培养孵箱Panaso
nic公司 日本PVDF膜 默克公司 德国粘附载玻片 世泰 中国盖玻片 世泰 中国玻璃分针 双玉 中国移液枪Gi
lson公司 法国滤纸沃华中国2.1.3 主要实验试剂名称公司产地碘伏消毒液上海利康中国PBS粉末雷根生物中国蔗糖Biofr
oxx公司 德国OCT包埋剂美国樱花 美国磷酸酶抑制剂MedChemExpress公司 中国蛋白酶抑制剂MedChemExpres
s公司 中国RIPA裂解液博彩生物中国 BCA试剂盒北京索莱宝科技有限公司 中国甘氨酸Biofroxx公司 德国Tris-碱 Bi
ofroxx公司德国SDS粉末Biofroxx公司 德国SDS上样缓冲液碧云天公司 中国蛋白Marker擎科生物 中国甲醇广州化学
试剂厂 中国无水乙醇广州化学试剂厂 中国二甲苯广州化学试剂厂 中国TBST粉末武汉赛维尔生物 中国牛血清白蛋白BSABiofrox
x 德国封闭山羊血清原液 北京索莱宝科技有限公司 中国ECL发光液 碧云天公司中国兔GFAP抗体 Genetex公司美国鼠GMFB
抗体Proteintech公司 美国鼠GAPDH抗体 Proteintech公司 美国兔绿色荧光二抗 Abmrrt公司 中国鼠
红色荧光二抗 Abmrrt公司 中国兔红色荧光二抗 Proteintech公司 美国鼠绿色荧光二抗 Proteintech公司 美
国DAPI 碧云天公司中国Triton X-100 中杉金桥中国30%Acr-Bis 雷根生物中国1.5mol/LTris-HC(
pH8.8) 雷根生物中国0.5mol/LTris-HC(pH6.8) 雷根生物中国四甲基乙二胺（TEMED） 麦克林公司中国
过硫酸铵（AP） 麦克林公司中国吐温-20 威佳生物有限公司 中国2.2 实验方法2.2.1 小鼠创伤性脑损伤模型的建立本实验
采用的是闭合性脑损伤模型，主要是依据Flierl等人先前报道的改良的自由落体法建立该模型[48, 49]。首先使用1%戊巴比妥钠腹
腔注射，待小鼠麻醉后，俯卧位固定，备皮，碘伏消毒头皮，将头皮沿矢状线切开，暴露颅骨，将暴露的颅骨置于撞击装置下方，使用立体定位注射
仪定位，于冠状缝后1.5 mm,矢状缝右侧旁开2.5 mm处钻取一直径约5 mm的骨窗，保持硬膜完整。调整撞击头与定位明确的颅骨表
面接触后，从25 cm处高度释放约20g的砝码。造模完成后碘伏消毒切口，缝合头皮。将小鼠放至37℃恒温垫上，等待其复苏后转移至动物
房，给予充足的水和食物。实验设置的对照组即小鼠仅切开与缝合头皮，实验组小鼠则按照上述造模方式处理。整个造模过程需保证在无菌条件下进
行，避免感染引起造模小鼠的死亡。2.2.2 脑组织取材固定及冰冻标本的制备（1）取材：在C57小鼠TBI造模后（1天、3天、5天
），用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，经心脏灌注生理盐水后断头取脑，一部分造模的小鼠用于Western blot实验，即分别钳取对照组和实
验组小鼠脑皮质相同部位组织，置于1.5 mLEP管中放入-80℃冰箱保存，以备后续Western blot实验使用。（2）固定：另
一部分造模小鼠的鼠脑完整取下后立即放入4％多聚甲醛中，室温中固定1小时后转至4℃冰箱中继续固定24小时。（3）蔗糖脱水：将固定好的
标本用PBS冲洗一次后，首先放置到本实验室自行配制的15%蔗糖溶液中脱水36小时，组织沉底后转移至30%蔗糖溶液中脱水36小时，所
有标本均按照此方法进行梯度脱水。（4）OCT包埋：脱水结束后使用OCT包埋剂包埋标本，包埋前用无尘吸水纸吸去标本上的水分，包埋好后
立即将标本转移至-80℃冰箱。（5）切片：在冰冻切片机中进行切片，切片厚度调整为30 μm，将切下的冰冻切片漂于装有PBS的24孔
板中备用，每个切下的标本要做好标记。2.2.3 免疫荧光（一）漂片法：（1）编号、洗涤：将24孔板中的漂片按照先前做好的标记依次
进行编号，用PBS洗涤3遍，每遍5分钟，洗去包埋剂。（2）封闭及通透：使用PBS稀释封闭山羊血清原液，配制成3%的封闭液工作液，同
时向配制好的封闭液中加入Triton X-100，按照Triton X-100：封闭液=3：1000的体积比进行配制，使其终浓度为
0.3‰。将孔板中的PBS吸尽，向每个孔中加入200 μL按上述方法配制好的封闭通透液，保证封闭液能完全覆盖脑组织，室温下在摇床上
缓慢摇晃封闭、通透15分钟。（3）洗涤：封闭结束后，将封闭通透液吸尽，再次用PBS洗涤3遍，每遍5分钟。（4）一抗孵育：首先配制3
%的封闭液，一抗溶液的配制按照一抗：封闭液=1:200的体积比进行配制。向每个孔中加入200 μL配制好的一抗溶液，在4℃冷室摇床
上孵育48小时。（5）二抗孵育：一抗孵育结束后，回收一抗溶液并置于4℃冰箱保存。使用PBS清洗5分钟，共清洗3遍。吸尽孔板中PBS
，按照一抗种属来源加入对应的兔荧光二抗或鼠荧光二抗，每孔200 μL，在室温下置于摇床上避光孵育1h。（6）洗涤：二抗孵育结束后，
弃二抗溶液，PBS清洗二抗溶液5分钟，共清洗三遍。（7）封片：使用粘附载玻片，按照标本标号一一对应玻片进行编号，向每个粘附载玻片上
滴上饱满的PBS液滴，将孵育好的脑组织切片使用玻璃分针尖端捞起，置于事先滴好的水滴上，待标本在水滴中平铺于载玻片上后，用枪头吸走标
本周围水分，向每个标本加100 μL含DAPI的抗荧光淬灭剂进行细胞核的染色及封片。使用共聚焦显微镜进行成像。第（5）步以后的步骤
均在避光条件下进行。2.2.4 Western blot检测（一）样品处理组织总蛋白的提取:小鼠断头取脑后取新鲜脑组织于1.5
ml离心管中置于冰上，向每个离心管中加入200 ul RIPA裂解液裂解,同时每个离心管中磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂按照RIPA：
蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=100:1:1的体积比加入混匀。然后向离心管中加磁珠，置于研磨仪上进行研磨。需要注意的是研磨仪底座要提
前置于-80℃预冷10 min，研磨仪参数设置为：研磨总次数3次，研磨预设频率60.00 HZ，研磨中断时间5秒，研磨运行时间60
秒。研磨结束后样品置于提前预冷的4℃离心机中以12000 rpm的离心转数离心15分钟。离心结束后将上清转移至新的离心管中。以上操
作过程需在冰上进行。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒计算总蛋白浓度。具体试剂配制及准备如下：配制工作液：根据标准品和样品数量计算出各试
剂所需的总量，BCA试剂和Cu试剂按50:1配制成BCA工作液，充分混匀；稀释标准品：取10 μL BSA标准品用PBS稀释至10
0 μL，使BSA工作液终浓度为0.5 mg/mL。将标准品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 μL的顺序依次加
到96孔板的蛋白标准品孔中，再加入相应PBS将体积补足至20 μL；将每个需测量的样品以2 μL的量逐个加入九十六孔板样品孔中，每
个孔用18 μL PBS将体积补足至20 μL；向各孔加入200 μL 事先配制好的BCA工作液后，置于37℃孵箱放置30分钟，孵
育结束后用酶标仪测定A562 nm处的吸光度,根据标准品吸光度与浓度的关系绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出蛋白浓度。标准品孔样品
孔孔号012345678910BSA蛋白标准溶液（μl）024681012162000H2O（μl）201816141210840
1818Mix（A+B）（μl）200200200200200200200200200200200样品（μl）0000000002
2表2-1 BCA蛋白浓度测定法加样方法测定完吸光度后，将每个离心管中获得的样品按照样品：5×Loading Buffer的体积
=4:1比例混合，置于100℃金属浴加热5分钟，待冷却恢复至室温后，每个样品分装约50 μL至离心管中置于-20℃冰箱保存用于近期
实验，未分装的样品置于-80℃冰箱保存，避免后期实验过程反复使用样品导致样品反复冻融。（二）配胶配胶前将玻璃板洗干净，最后用蒸馏水
冲洗，晾干。实验中使用的分离胶及浓缩胶配制方法如下（以下方法均是配制两块凝胶所需的成分用量）：各组分名称体积（ml）蒸馏水4.13
0%Acr-Bis10.5mol/LTris-HC(pH6.8)0.7510%SDS0.0610%过硫酸铵（灌胶前加）0.06TE
MED（灌胶前加）0.006总体积6表2-2 5%浓缩胶配制方法各组分名称体积（ml）蒸馏水5.930%Acr-Bis51.5m
ol/LTris-HC(pH8.8)3.810%SDS0.1510%过硫酸铵（灌胶前加）0.15TEMED（灌胶前加）0.006总
体积15表2-3 10%分离胶配制方法按上述表格中的方法配制好分离胶后，缓慢向玻璃板中灌入分离胶，用无水乙醇封胶，同时去除气泡。
分离胶凝固之前尽量不要去移动或者摇晃配胶装置，以免影响配胶质量，对电泳结果产生影响。待分离胶凝固后弃无水乙醇（分离胶凝固时间大约3
0分钟），用滤纸吸走残留在玻璃板上的无水乙醇，然后倒入按照上述方法提前配好的浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后即可使用。配胶时需注意
：在倒入浓缩胶后，插入梳子和拔除梳子时均应防止气泡进入梳孔使梳孔变形，影响电泳结果。（三）SDS-PAGE电泳按照每孔30 ug的
加样量计算出加样体积后，安装电泳设备，向其中倒入电泳液，两玻璃板间的电泳液需保证能将梳孔浸泡在其中，准备好后进行加样，加样顺序按照
自己所需排版顺序安排，加样时动作轻柔，避免冲击梳孔底部的胶，也会影响电泳效果。加样完毕后，向第一个孔中加入6 μL蛋白Marker
。样品在浓缩胶中电泳时使用80 V的电压，进入到分离胶中时使用110V的电压，总电泳时长约2个小时。电泳结束后根据蛋白Marker
的条带指示位置，确定目的蛋白的位置进行切胶后转膜。本实验使用的转膜液主要为实验室自行配置，配置5×电泳缓冲液保存于4℃冰箱，使用时
用蒸馏水将其稀释成1×电泳缓冲液。配置的5×电泳缓冲液需在2周内使用完。配制方法如下：各组分名称加样量（g）Tris-碱15.1甘
氨酸94.0SDS5.0表2-4 5×电泳缓冲液的配制方法加入800 mL蒸馏水使溶质充分溶解，溶解后再加蒸馏水将溶液定容至10
00 mL备用。（四）转膜在电泳结束前20分钟左右换上新的手套开始准备物品，需要准备的物品：1×转移缓冲液、甲醇、转膜用的夹子、两
块海绵垫、3张剪好的滤纸、镊子、一张PVDF膜。剪切滤纸和膜时都需换上新手套，避免手上的蛋白污染膜，影响转膜后的效果。转膜前，PV
DF膜应在甲醇溶液中浸泡5-10秒钟，保证膜浸湿为止，然后取出放置在转膜平衡液中平衡。将转膜用的夹子阴极板（黑色）、海绵垫、滤纸按
顺序叠放后浸泡于转膜缓冲液中，取出切好的SDS-PAGE胶放于滤纸上，除去所有气泡，将平衡好的PVDF膜置于凝胶上，玻棒来回擀几遍
排除所有气泡。注意在膜的正面剪去左上角作为标记，在膜上覆盖转移缓冲液浸泡过的滤纸，同样须确保不留气泡。最后盖上另一张海绵垫，盖上阳
极板（白色），夹紧后将夹子放入转移槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。转膜时将转移槽放入冰块中进行，以免产热过多
。转膜时一般用恒压80 V转膜60 min。本实验使用的转膜液主要为实验室自行配置，配置5×转膜液保存于4℃冰箱，使用时用蒸馏水和
甲醇将其稀释成1×转膜缓冲液，配制时的体积比=1:1:3。配置的5×转膜缓冲液需在2周内使用。配制方法如下：各组分名称加样量（g）
Tris-碱15.15甘氨酸72.0表2-5 5X转移缓冲液的配制方法加入800 mL蒸馏水使溶质充分溶解，溶解后再加蒸馏水将溶
液定容至1000 mL备用。稀释成1×转移缓冲液时，需向100 ml的5×转移缓冲液中加入300 mL蒸馏水和100 mL甲醇。（
五）膜的封闭与抗体孵育1、封闭：转膜结束后，将膜取出置于装有5%BSA封闭液的15 mL离心管中，水平放置于室温下的摇床上，封闭1
.5小时，确保封闭液能充分与膜接触。所用到的5%BSA封闭液，是使用牛血清白蛋白BSA粉末溶解于配置好的1 ×TBST溶液中制成。
2、一抗孵育：封闭结束后将膜转移至对应的目的蛋白的一抗溶液中，在4℃冷室的摇床上孵育过夜，一抗一般孵育15小时及以上。孵育过程中确
保一抗溶液能充分与膜接触，如有两条条带在同一溶液中同时进行孵育，必须保证两条条带背面与背面相对，以保证有蛋白一面与一抗溶液充分接触
。一抗溶液是用5%BSA封闭液稀释。GFAP一抗溶液是按照1:5000的体积比进行稀释，GMFB一抗溶液按照1:1000的体积比进
行稀释。GAPDH一抗溶液按照1:10000的体积比进行稀释。3、洗涤、二抗孵育：一抗孵育结束后使用1×的TBST溶液对条带进行洗
涤，共洗涤3遍，每遍5分钟。洗涤后根据孵育时用到的一抗种属来源，将条带转移至相应种属的二抗溶液中（抗鼠或抗兔），室温下摇床孵育1小
时。二抗溶液使用1×TBST溶液稀释，兔抗和鼠抗均按照1:7500体积比进行稀释。孵育结束后TBST进行洗涤，共洗涤3遍，每遍5分
钟。洗净后可进行化学发光。本实验使用到的TBS粉末配制，使用蒸馏水将TBS稀释成1×的溶液，向每1 L溶液中加入1 mL 吐温20
后配成1 ×的TBST后即可直接使用。（六）免疫学检测取ECL发光液A液B液按1:1等量混匀，取出浸泡在TBST中的膜，滤纸将膜上
的TBST溶液稍吸干后（但不能使膜干燥），置于混合好的ECL化学发光液中，使PVDF膜充分与发光液接触，可用枪头来回吹吸，置于暗室
显色约30秒钟。将膜的正面朝上置于化学发光仪中进行检测。2.2.5 使用的软件及分析方法本章每个实验重复3次及以上，所有获得的蛋
白条带使用imagej软件进行蛋白条带的灰度值分析，所得到的数据均使用Graphpad Prism进行统计，使用到的统计方法主要是
单因素方差分析（one-way ANOVA）。实验结果取数据的平均值，数据使用均数±标准差来表示，P<0.05时认为结果有统计学意
义。2.3 实验结果2.3.1 创伤性脑损伤后脑组织中GMFB表达水平先于GFAP升高为了验证GMFB在TBI后的大脑皮质的表
达情况，我们提取TBI后0 d，1 d，3 d，5d的小鼠大脑皮质组织，并使用western blot技术检测GMFB在其中的表达
，结果显示野生型小鼠对照组脑皮层中GMFB蛋白呈低表达水平，而在创伤性脑损伤造模后1天，小鼠损伤部位的脑组织GMFB蛋白的表达开始
升高，此后至创伤性脑损伤后第3天、第5天，GMFB蛋白始终保持一个较高水平（图2-1 A,B）。我们也通过Western blot
对星形胶质细胞活化的特异性标志GFAP蛋白表达的检测，我们观察到在损伤后1天，皮层脑组织中GFAP蛋白的表达与对照组无表达无显著差
异。在损伤后第3天，GFAP表达开始升高，损伤后第5天，GFAP表达进一步升高（图2-1 A,C）。 （A）（B）
（C）Figure2-1 Astrocyte activation and in
creased GMFB expression levels were increased after TBI. A: Weste
rn blot analysis of GMFB and GFAP protein in mouse cortical brain
tissue with GAPDH as a loading control.?B,C: Quantitative analys
is of the gray values of the western blot analysis results in Fig
ure A. The expression level of GMFB in different days after injur
y (B) and GFAP in different days after injury (C) .Error lines re
present the ± standard deviation. Each point on the bar graph rep
resents one mouse, with three mice per group.?Statistical analysi
s one-way ANOVA. (B,F (1.325, 2.650) = 28.07,P=0.0172;?multiplici
ty adjusted P values: control group vs 1d: P = 0.0346;?Control gr
oup vs 3d: P =0.0080;?Control group vs 5d: P = 0.0345,C,F (3, 8)
= 76.33,P<0.0001;?multiplicity adjusted P values: control group v
s 1d: P = 0.9538;?Control group vs 3d: P =0.0073;?Control group V
S 5d:P<0.0001) .图2-1 创伤性脑损伤后星形胶质细胞的活化和GMFB表达水平升高。A：小鼠大脑皮层脑组织中GMFB
、GFAP蛋白的免疫印迹分析，其中GAPDH 作为内参。B，C：A图中的免疫印迹分析结果的灰度值的量化分析，GMFB在损伤后不同天
数的表达水平（B），GFAP在损伤后不同天数的表达水平（C）。误差线代表±标准差，柱状图上每个点代表一只小鼠，每组三只小鼠。使用单
因素方差分析（ B,F (1.325, 2.650) = 28.07，P=0.0172；多重比较的P值：对照组vs 1d: P =
0.0346；对照组vs 3d: P =0.0080；对照组vs 5d: P = 0.0345；C,F (3, 8) = 76.
33，P<0.0001；多重比较的P值：对照组vs 1d: P = 0.9538；对照组vs 3d: P =0.0073；对照组v
s 5d: P<0.0001）。2.3.2 创伤性脑损伤后脑组织中GFAP阳性星形胶质细胞中表达GMFB为了观察创伤性脑损伤后活
化的星形胶质细胞中GMFB的表达情况，我们在对照组小鼠和造模后3天的小鼠脑组织切片上进行了GMFB与GFAP的免疫荧光双染色标记。
免疫荧光双染结果显示：未损伤情况下，野生型小鼠脑皮层的GFAP阳性细胞中未观察到明显的GMFB表达（图2-2 A），损伤后3天，皮
层的GFAP阳性星形胶质细胞中可以检测到GMFB的表达（图2-2 A）。 （A）Figure 2-2 GMFB was expre
ssed in GFAP-positive cells . A: The upper panels is the brain se
ction of the mouse control group, and the lower panels is the bra
in section of the mouse 3 days after traumatic brain injury, whic
h are labeled with GMFB and GFAP. Arrows indicates that the astro
cytes have no GMFB(leftr panels) or GMFB(right panels). Scale bar
s：10μm.图2-2 GMFB在GFAP阳性细胞中表达。A：上方图片为小鼠对照组脑组织切片，下方图片为小鼠损伤后3天脑组织切片，
均使用GMFB和GFAP进行标记。箭头所指为星形胶质细胞中没有GMFB（左列图片）或有GMFB（右列图片）。图片标尺：10μm。2
.4 结果分析我们的实验检测到成年小鼠脑在生理状态下，其大脑皮层脑组织中GMFB蛋白呈现出低表达水平。在创伤性脑损伤造模后1天，
脑皮层组织中GMFB表达水平即开始升高，并在接下来的5天内都维持一个较高表达水平。星形胶质细胞作为参与脑损伤应答的重要细胞类型，它
不是在损伤后即刻就发生活化，从星形胶质细胞开始活化至星形胶质细胞瘢痕形成需要经历一个较长的过程以及较多环节，如肥大、极性改变、增殖
、迁移、瘢痕形成等，这是一个连锁的过程，这一过程中这些环节都有可能受各种因素的调控[8, 10-12, 50-52]。创伤性脑损伤
后3天，星形胶质细胞开始活化，其特异性标志物GFAP蛋白表达开始升高。这提示，GMFB表达的升高先于星形胶质细胞活化。另外，免疫荧
光结果检测到创伤性脑损伤后3天，GFAP阳性星形胶质细胞中能检测到GMFB的表达。这一现象与本课题组先前在野生型小鼠的脑组织中检测
到的TBI后损伤部位周围GMFB阳性分支细胞与GFAP的共定位是一致的[44]。GMFB与GFAP蛋白的这种时间和空间表达模式特征
提示：TBI后GMFB蛋白表达的升高可能参与调节星形胶质细胞活化过程。第3章 敲除Gmfb使创伤性脑损伤后星形胶质细胞的复杂性升
高3.1 实验材料3.1.1 实验动物C57BL/6野生型小鼠(雄性，8-10周)，均购于广东省实验动物中心。Gmfb突变小鼠
购自上海生物生物科技有限公司，是在C57BL/6小鼠背景上，利用CRISPR/Cas9技术获得Gmfb基因敲除的纯合子小鼠。纯合子
与野生型杂交后产生F1代杂合子小鼠，F1代杂交产生的F2代小鼠进行鼠尾基因鉴定，实验使用的老鼠是采用以上方式杂交后产生的的纯合子和
野生型小鼠进行（8-10周，雄性）。所有动物均饲养在可以自由获取食物和水的标准环境中，环境室温维持在20-24℃之间，保持相对湿度
在45-65%之间，给予12小时的光-暗循环。3.1.2 实验器材名称公司产地自由落体脑损伤模型击打器安徽正华生物 中国 组织
研磨仪 上海净信 中国酶标仪BIOTEK公司 美国1.5mL离心管 Axygen公司 美国Western blot转印电泳仪
Bio-Rad公司美国自动发光仪 宝特科技中国小鼠恒温垫 耀坤 中国冰冻切片机 徕卡（Leica）德国石蜡包埋机
徕卡（Leica）德国石蜡切片机 徕卡（Leica）德国刀片 徕卡（Leica）德国粘附载玻片 世泰 中国盖玻片
世泰 中国暗盒 凯圳 中国24孔板 康宁 美国96孔板 康宁 美国玻璃分针 双玉 中国水平摇床Orb
ital公司 德国PCR仪 Bio-Rad公司美国琼脂糖凝胶电泳仪 北京六一生物科技有限公司 中国PCR八联管
Axygen公司 美国远红外发光仪Aplegen公司 美国移液枪 Gilson公司 法国3.1.3 主要实验试剂名
称公司产地碘伏消毒液 上海利康 中国PBS粉末 雷根生物 中国多聚甲醛雷根生物 中国蔗糖 Biofroxx公司
德国OCT包埋剂 美国樱花 美国磷酸酶抑制剂MedChemExpress公司 中国蛋白酶抑制剂 MedChemExpre
ss公司 中国RIPA裂解液博彩生物 中国 BCA试剂盒 北京索莱宝科技有限公司 中国甘氨酸Biofroxx公司 德国Tris
-碱 Biofroxx公司 德国SDS粉末Biofroxx公司 德国SDS上样缓冲液碧云天公司 中国牛血清白蛋白BSA Biofr
oxx 德国封闭山羊血清原液北京索莱宝科技有限公司中国ECL发光液碧云天公司 中国Triton X-100 中杉金桥 中国
兔GFAP抗体Genetex公司 美国鼠GMFB抗体Proteintech公司 中国鼠GAPDH抗体Proteintech公
司 中国辣根酶标记山羊抗鼠IgG 中杉金桥 中国辣根酶标记山羊抗兔IgG 中杉金桥 中国488标记的山羊抗兔Ig
G艾比玛特 中国594标记的山羊抗鼠IgG艾比玛特 中国含DAPI抗荧光淬灭剂 碧云天公司 中国TAE缓冲液实
验室自配琼脂糖凝胶粉末 Biowest公司 西班牙PCR试剂盒 Takara公司 日本组织裂解液 实验室自配蛋白酶K 威
佳生物有限公司 中国DNA电泳Marker Takara公司 日本核酸凝胶染料 擎科生物 中国Nissl染色液 碧云
天公司 中国引物 华大基因 中国表3-1 鼠尾基因鉴定引物（P1P2）Primer Sequence (5’→3’)P1CAG
TAACCAGAGTATTGCTTGC ForwardP2TTCACATTAAATCCTACGAACA Reverse表3-2
鼠尾基因鉴定引物（P3P4）Primer Sequence (5’→3’)P3 CCAGAGTATTGCTTGCCT For
wardP4TAAAATGCCATCCGTTCA Reverse3.2 实验方法3.2.1 鼠尾基因鉴定（一）鼠尾DNA的提
取1、需鉴定的小鼠在出生后4周进行公母分笼，待小鼠6周左右，从鼠房取出需要进行基因型鉴定的小鼠，抓取小鼠时动作轻柔，避免让小鼠受到
惊吓，剪小鼠指甲取样，尽量避免小鼠脚趾出血受伤，取下的样品放置于事先编好好的1.5 mL的EP管中，将装有样品的1.5 mL的EP
管置于冰上暂时保存，小鼠编号规则按下图进行，做好标记以便鉴定后分笼和实验；Figure 3-1 Mouse numbering l
abeling rules.图3-1 小鼠编号标记规则。2、按照顺序取完样后，配制组织裂解液，每个EP管中的样品需加入组织裂解液5
00 μL和10 mg/mL的蛋白酶K50 μL。溶液的配制按照样品总数量计算出两种试剂分别所需的总量进行充分混合，向每个装有小鼠
组织的EP管中加入500 μL组织裂解液混合液，保证组织完全浸没在裂解液中。将装有组织和裂解液的EP管置于恒温震荡培养箱中震荡过夜
，温度设置为57℃。这一过程需注意，必须盖紧EP管的盖子，避免漏液。3、次日取出EP管后，室温静置10分钟，静置完毕后将EP管转移
至离心机中，以12000 rpm离心10分钟；4、离心结束后，将上清转移至新的并写有对应编号的EP管中，向每个EP管中加入1 mL
无水乙醇（加入的无水乙醇体积约等于上清液体积的两倍），盖紧EP管盖子后轻摇可见白色絮状沉淀，转移至离心机中以13000 rpm离心
，共离心15分钟；5、离心结束后弃上清（动作轻柔，避免用力倾倒），向每个EP管中加入1 mL75%乙醇，盖紧盖子后转移至离心机中再
次以13000 rpm转速离心，共15分钟；6、弃75%乙醇，收集沉淀，将EP管置于通风橱中晾10-15分钟后，向每个EP管中加入
80-150 μL DEPC水，盖好盖子置于室温下以溶解DNA（不可置于室温下过夜），溶解后保存于4℃冰箱中备用。普通PCR在冰上
配制PCR体系，按照下表进行配置；表3-3 鉴定Gmfb基因敲除小鼠的PCR试剂体系配置Reactive Component
Volume（μL）蒸馏水 8Taq酶 10Primer I (10pmol/μl) 0.5Primer II
(10pmol/μl) 0.5Tail genomic DNA 1Total Volum
e 20放入PCR仪进行反应，反应的条件如下：表3-4 基因敲除鉴定的PCR扩增反应条件(P1P2)Step te
mp(℃) Time Note1 94 5min2
94 30sec repeat 3 58
30sec steps 2-4 4 72 1.5min
for5 72 5min 35cycles6 12
hold表3-5 基因敲除鉴定的PCR扩增反应条件(P3P4)Step temp(℃) Time
Note1 94 5min2 94
30sec repeat 3 55 30sec
steps 2-4 4 72 1min for5 72
5min 35cycles6 12 hold（三）琼脂糖凝胶电泳配胶：通常配制1.5%琼脂糖凝胶，
即将1.5g琼脂糖粉末溶解到1 X TAE溶液中，在玻璃烧杯中溶解，放置到微波炉中加热至沸腾，待冷却至60 ℃时加0.001%的无
毒的核酸染料混匀，缓慢倒入插有梳子的胶板上，备用；加样：向每一行第一个孔中加入DNA Marker 5 μL，其余各孔按照样品编号
顺序依次加入扩增后的DNA样品，每个孔加样量为8 μL；电泳：110V恒压电泳，40分钟，电泳至核酸染料跑到胶底部边缘时停止电泳；
成像：将凝胶置于紫外线曝光仪下，调整合适参数进行成像，按照条带数的位置区分小鼠基因型，将相同基因型的小鼠分笼。3.2.2 小鼠创
伤性脑损伤模型的建立依据Flierl等人先前报道的改良的自由落体法建立闭合性脑损伤模型。具体方法同前。对照组小鼠仅切开与缝合头皮，
实验组小鼠则按照上述造模方式处理。整个造模过程在无菌条件下进。分组有野生型对照组，野生型实验组，纯合子对照组，纯合子实验组。3.2
.3 脑组织取材固定及标本制备（一）取材固定（1）取材：在C57小鼠及Gmfb敲除小鼠上TBI造模后（1天、3天、5天、14天）
，以及未造模的小鼠用1%戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉成功后经心脏灌注生理盐水后断头取脑，分别钳取3只对照组和每个时间点各3只实验组小鼠
脑皮质部位组织置于1.5 mLEP管中，放入-80℃冰箱保存，以备后续Western blot实验使用；（2）固定：另一部分造模小
鼠的鼠脑完整鼠脑取下后立即放入固定剂4％多聚甲醛中，室温中固定1小时后转至4℃冰箱中继续固定24小时。（二）冰冻标本制备（1）蔗糖
脱水：将固定好的标本用PBS冲洗一次，依次放置到本实验室自行配制的15%蔗糖溶液中36小时，组织沉底后转移至30%蔗糖溶液中36小
时，所有组织冰冻标本均按照此方法进行梯度脱水；（2）OCT包埋：脱水结束后使用OCT包埋剂包埋标本，包埋前用无尘吸水纸吸去标本上的
水分，包埋后立即转移至-80℃冰箱，减少冰晶的形成；（3）切片：在冰冻切片机中进行切片，切片厚度为30 μm，将切下的冰冻切片漂于
装有PBS的24孔板中备用。（三）石蜡标本制备（1）梯度酒精浓度脱水：将固定后的标本置于塑料包埋盒中，编号并标记样本名称，蒸馏水冲
洗数秒，将组织置于酒精中脱水。脱水时按以下浓度梯度顺序依次进行：在70％酒精中脱水1小时后，转移至80％酒精中，1小时，转移至85
％酒精，1小时，转移至90％酒精，1小时，转移至95％酒精，1小时，转移至100％酒精30分钟，再更换新鲜100％酒精，浸泡30分
钟；（2）透明：脱水完毕后进行透明，在通风橱中完成，二甲苯I，30分钟，转移至二甲苯II，30分钟；（3）透蜡：从二甲苯中取出后转
移至石蜡I浸透1小时后，转移至石蜡II，浸泡过夜；（4）包埋：在石蜡包埋机中进行，用L型金属包埋框包埋。金属模具接适量石蜡，将已完
成脱水浸蜡的脑组织放入盛有进口石蜡的金属框模具中央，将金属框放于石蜡包埋机的冷台上冷却使标本固定在石蜡模具中央，同时快速将塑料包埋
盒上写有标记的一面覆盖到石蜡上以方便后续切片使辨认和使用；（5）修蜡块：将蜡块修切成梯方形，将组织以外的多余蜡块修去，但注意勿太靠
近组织，让组织四周留有少许石蜡；这样不至因组织周围留蜡过少而切片破碎或困难，同时，蜡块两边必须切成平行的直线，可以避免切下的蜡条弯
曲；（6）切片：在石蜡切片机中进行，将刀片装到切片机上，将预定使用的刀口部位移至蜡块下方，蜡块固定在切片机上，调整好角度，松开转轮
固定器使转轮缓缓下降，使石蜡稍离道口。调整刻度指针到7 μm，用右手握转轮把柄，摇转切片机，左手用一毛笔拖住蜡带，随着切片机的转动
，轻轻把切下的石蜡标本拉开。用毛笔拖住蜡带，挑断后放于装有蒸馏水的盒子中展开；（7）烤片：在40℃水浴锅中展片后用载玻片捞起，捞片
时注意避免气泡的产生，这会使标本在后期的实验中容易脱片，同时也影响制片质量。将玻片置于60℃烤箱中烤2小时，室温放置半小时后，储藏
于切片盒备用。3.2.4 免疫荧光（1）编号、洗涤：将24孔板中的漂片依次进行编号和标记，用PBS洗涤3遍，每遍5分钟，洗去包埋
剂；（2）封闭及通透：使用PBS稀释封闭液原液，配制成3%的BSA封闭液，同时向配制好的BSA封闭液中加入Triton X-100
，使其浓度为0.3%。将孔板中的PBS吸尽，向每个孔中加入200μL封闭通透液，保证封闭液覆盖脑组织，室温下在摇床上摇晃封闭15分
钟；（3）洗涤：将封闭液吸尽，再次用PBS洗涤3遍，每遍5分钟；（4）一抗孵育：加入一抗溶液（按1:200配制）在4℃冷室摇床上孵
育48小时；（5）二抗孵育：一抗孵育结束后，回收一抗。使用PBS清洗5分钟，清洗3遍。吸尽孔板中PBS，按照一抗种属来源加入对应的
兔荧光二抗或鼠荧光二抗，每孔200 μL，室温下摇床上孵育1 h；（6）洗涤：二抗孵育结束后，弃二抗溶液，PBS清洗二抗溶液5分钟
，共清洗三遍；（7）封片：使用粘附载玻片进行编号，向每个粘附载玻片上滴一滴饱满的水滴，将孵育好的脑组织切片使用玻璃分针尖端捞起，置
于事先滴好的水滴上，待标本平铺于载玻片上后，用枪头吸走标本周围水分，向每个标本加100 μL 含DAPI的抗荧光淬灭剂进行细胞核的
染色及封片。使用共聚焦显微镜进行多层扫描三维成像，用于后期Sholl分析。3.2.5 尼氏染色（Nissl染色）本实验使用上述石
蜡标本制备的方法制成的标本进行染色。（1）脱蜡：将切好的标本置于新鲜二甲苯中脱蜡5分钟，共三次，每次更换新的二甲苯，保证脱蜡充分，
以确保最终理想的染色效果。脱蜡后依次转移至无水乙醇浸泡5分钟。90%乙醇浸泡2分钟。70%乙醇浸泡2分钟。最后浸泡在蒸馏水洗涤2分
钟；（2）Nissl染色：完成上述操作后，将载玻片上的水分擦干后，使用免疫组化笔在每个脑组织周围画圈，保证加入染色液后染色液不向外
扩散，向画好的圈内滴加染色液，染色时在37℃孵箱中进行，染色10分钟；（3）染色结束后弃染色液，将标本置于蒸馏水中洗涤2次，每次数
秒钟，将标本置于95%乙醇中放置约5秒，然后使用70%乙醇洗涤2次，每次数秒；（4）脱水：95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95%乙
醇再脱水2分钟；（5）透明：脱水后使用新鲜二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟；（6）封片：待标本干燥后，使用中性树胶
封片，封片时注意避免气泡形成。在体式显微镜下观察、成像。3.2.6 Western blot检测本章中Western blot检
测主要是为了从蛋白水平检测野生型小鼠及Gmfb敲除小鼠脑皮质中GMFB的表达情况，因此主要取了野生型对照组小鼠和敲除Gmfb的对照
组小鼠的脑皮质蛋白进行了实验，具体实验方法同第一章中所述。3.2.7 sholl分析及数据统计本实验使用Fiji软件的Sholl
分析插件对星形胶质细胞形态进行分析，主要分析星形胶质细胞的分叉数目。原理是以胞体为中心，由内向外画同心圆，每增加5微米做一个同心圆
。对星形胶质细胞突起进行追踪后，将其突起叠加到同心圆上，计算距离星形胶质细胞胞体不同距离范围内的每个同心圆与星形胶质细胞突起的交点
数目，计做星形胶质细胞的突起分支数目。以上设置的4个组别中，每组分别对从各自的3只小鼠收集到的的共30个星形胶质细胞的细胞突起数目
进行了量化。所获得的数据最终使用Graphpad Prism软件进行统计，使用到的统计方法主要是双因素方差分析（two-way A
NOVA）。实验结果取数据的平均值，数据使用均数±标准差来表示，P<0.05时认为结果有统计学意义。3.3 实验结果3.3.1
Gmfb敲除的验证通过如前所述的方法繁殖获得Gmfb基因敲除小鼠和野生型小鼠，在进行实验前均进行了Gmfb基因敲除情况的验证。分
别使用了琼脂糖凝胶电泳、Western blot、免疫荧光等方法进行验证。琼脂糖凝胶电泳结果显示，以P1P2为引物进行扩增后获得的
产物在电泳后，在480 bp处显示有条带的即为纯合子，在989 bp处显示有条带的即为野生型（图3-2 A）。通过对小鼠脑皮质提取
的蛋白进行Western blot检测，纯合子不表达GMFB蛋白（图3-2 B）。脑组织GMFB免疫荧光染色发现，纯合子脑组织中检
测不到GMFB荧光（图3-2 C）。3.3.2 敲除Gmfb后小鼠脑的解剖结构未见明显异常通过对小鼠发育外观、形态的观察发现，相
比同周龄野生型小鼠，敲除Gmfb后小鼠生长发育未见明显异常（图3-2 D）。通过采用尼氏染色的方法对小鼠脑组织切片染色，在体式显微
镜下观察小鼠脑组织大体解剖结构，发现敲除Gmfb后小鼠大脑解剖结构无明显异常（图3-2 E）。（A） （C） （D） （E）
Figure 3-2 Identification of Gmfb knockdown A：Agarose gel electro
phoresis. The figure on the left shows the electrophoresis result
s of the product obtained by PCR using P1P2 as primer. M stands f
or DNA Marker, the first column is the electrophoresis band of wi
ld-type mice, about 989bp, and the fourth column is the electroph
oresis band of homozygous mice after Gmfb knockout, about 480bp.
The figure on the right shows the results of PCR products using P
3P4 as primer. The arrow indicates the bands that occur in wild-t
ype mice and heterozygous mice, about 750bp. B：Western blot analy
sis of GMFB protein in mouse cerebral cortex brain tissue, with G
APDH as a loading control.?The expression of GMFB protein could b
e detected in wild-type mice, but not in homozygous mice. C: Immu
nofluorescence staining of GMFB on brain tissue section of wild-t
ype mice(left panel), and homozygous mice(right panel). Scale ba
rs：50μm.?D: Compared with wild-type mice and Gmfb knockout mice s
howed no abnormal gross development E:Nissl staining sections sho
wed no difference in brain anatomical structure between wild-type
mice and Gmfb knockout mice. Scale bars：50μm.图3-2 Gmfb敲除后的鉴定。A：琼
脂糖凝胶电泳。左图表示以P1P2为引物进行PCR后所获得的产物的电泳结果。M代表DNA Marker，Marker后第一列为野生型
小鼠的电泳条带，约989bp，第四列为敲除Gmfb后纯合子小鼠电泳条带，约480bp。右图表示以P3P4为引物进行PCR后所获得的
产物的电泳结果，箭头所指为在野生型小鼠及杂合子小鼠中会出现的条带，约775bp。B：小鼠大脑皮层脑组织中GMFB蛋白的免疫印迹分析
，其中GAPDH 作为内参。野生型小鼠可检测到GMFB蛋白的表达，纯合子小鼠检测不到GMFB蛋白的表达。C：野生型小鼠、纯合子小鼠
脑组织切片上的GMFB免疫荧光染色，左图为野生型小鼠，右图为纯合子小鼠。图片标尺：50μm。D：与野生型小鼠相比，敲除Gmfb小鼠
大体发育未见异常。E：Nissl染色切片显示野生型小鼠和敲除Gmfb的小鼠脑组织解剖结构无差异。比例尺：50μm。3.3.3 敲
除GMFB可逆转创伤性脑损伤后星形胶质细胞复杂性降低为了明确敲除Gmfb对星形胶质细胞的形态变化的影响，我们采用了先前文献中报道的
一种主要用于分析神经元的复杂性，也可用于量化星形胶质细胞复杂性的方法[53, 54]，即Sholl分析方法，分别对野生型小鼠和纯合
子小鼠的创伤性脑损伤前、后星形胶质细胞的形态改变进行量化分析。首先采用漂片法，对星形胶质细胞进行GFAP免疫荧光染色，并使用共聚焦
显微镜对荧光染色后的星形胶质细胞进行多层扫描三维成像（图3-3 A），继而对成像的GFAP阳性星形胶质细胞进行Sholl分析。量化
分析发现，未损伤状态下，野生型小鼠与纯合子小鼠的星形胶质细胞形态无明显差异（图3-3 B）。在野生型小鼠中，创伤性脑损伤后3天大脑
皮质损伤部位周围的星形胶质细胞在距离细胞胞体5-30微米处的细胞突起的分支数目减少，复杂性降低（图3-3 C）。说明在脑组织受到损
伤的情况下，星形胶质细胞会出现复杂性降低的改变。这与先前研究报道的结果是一致的[54]。在进一步对敲除Gmfb组小鼠大脑皮层中的星
形胶质细胞形态进行Sholl分析发现，创伤性脑损伤后3天，敲除Gmfb组小鼠大脑皮层损伤部位周围的星形胶质细胞突起分支数目没有出现
野生型小鼠中的改变，即在靠近星形胶质细胞细胞胞体一端细胞突起分支没有出现显著的减少。（图3-3 D）(A)（B） （C）（D）
（E）Figure 3-3 Morphological analysis of astrocytes. A: The mouse
brain sections were imaged under confocal microscopy after GFAP
immunofluorescence staining. Left panels are the wild type and ho
mozygous control group, and right panels are the brain sections 3
days after traumatic brain injury. Scale bars：10μm. B,C,D: Sholl
analysis of astrocyte morphology, a total of 30 astrocytes from
three mice were collected in each group for morphological analysi
s. B: Quantitative analysis of the results of Sholl analysis of a
strocytes in the control group. The analysis method used was two-
way ANOVA effect of distance from soma, F (58, 696) = 3.626, P＜0.
0001，no effect of genotype,F (1, 58) = 1.569，P=0.2152，no interact
ion, F (12, 696) = 1.269, P=0.2321）. C: Quantitative analysis of
the results of Sholl analysis of astrocytes in wild-type mice bef
ore and after injury. The analysis method used was two-way ANOVA
effect of distance from soma, F (58, 696) = 3.455, P＜0.0001,effec
t of injury,F (1, 58) = 67.17，P＜0.0001..Post hoc Sidak’s test,5μ
m，P＜0.0001，10μm，P＜0.0001，15μm，P＜0.0001，20μm，P＜0.0001，25μm，P＜0.000
1，30μm，P＜0.0001，as compared to control）.D: Quantitative analysis
of the results of Sholl analysis of astrocytes in Gmfb knockout m
ice before and after injury. The analysis method used was two-way
ANOVA effect of distance from soma, F (58, 696) = 4.230, P＜0.000
1,effect of injury,F (1, 58) = 12.20，P=0.0009,.Post hoc Sidak’s t
est,30μm，P=0.0061，40μm，P=0.0458，as compared to control）. E: Schem
atic diagram of tracking and calculating the number of astrocyte
bifurcation by Sholl analysis .The schematic diagram of wild-type
mouse astrocyte bifurcation is shown on the left, and the schema
tic diagram of astrocyte bifurcation after Gmfb knockout is shown
on the right.图3-3 星形胶质细胞的形态学分析。A：对小鼠脑组织切片进行了GFAP免疫荧光染色后在共聚焦显微镜下成
像。左侧一列为野生型和纯合子对照组脑组织切片，右侧列为创伤性脑损伤后3天脑组织切片。图片标尺：10μm。B，C，D：星形胶质细胞形
态的Sholl分析，每组收集了来自三只小鼠的共30个星形胶质细胞进行形态学分析。B：未损伤状态下星形胶质细胞Sholl分析结果。数
据分析采用针对距离胞体距离的双因素方差分析（F (58, 696) = 3.626, P＜0.0001，不同基因型之间无差异,F
(1, 58) = 1.569，P=0.2152，没有交互作用，,F (12, 696) = 1.269, P=0.2321.?）
。C：野生型小鼠损伤前及损伤后星形胶质细胞形态学分析。数据分析采用针对距离胞体距离的双因素方差分析（F (58, 696) = 3
.455, P＜0.0001,损伤的效应 ,F (1, 58) = 67.17，P＜0.0001. Post hoc Sidak’
s test,和对照组比较时，5μm，P＜0.0001，10μm，P＜0.0001，15μm，P＜0.0001，20μm，P＜0.
0001，25μm，P＜0.0001，30μm，P＜0.0001，）。D：敲除Gmfb小鼠损伤前及损伤后星形胶质细胞形态学分析。数
据分析采用针对距离胞体距离的双因素方差分析（F (58, 696) = 4.230, P＜0.0001,,损伤的效应,F (1,
58) = 12.20，P=0.0009.Post hoc Sidak’s test,和对照组比较时，25μm，P=0.0061，
35μm，P=0.0458）。E：Sholl分析方法追踪及计算星形胶质细胞突起分支数目的示意图。左侧为野生型小鼠星形胶质细胞突起分
叉示意图，右侧为敲除GMFB后星形胶质细胞突起分叉示意图。3.4 结果分析课题组研究人员前期研究发现，在生理状态下，GMFB在发
育成熟的斑马鱼脑组织中低表达[32]。既往也有研究报道敲除Gmf对小鼠来说是非致死性的，且敲除Gmf的小鼠中，它的简单的位置辨别能
力和空间记忆能力没有缺陷[33, 34, 55]。GMFB最初也是从损伤的组织中分离提取出来的，不断的研究探索也发现GMFB与许多
疾病的发生是相关的[35, 37-41]。这可能表明在正常生理状态下，GMFB对成年后中枢神经系统的稳态维持及一些神经活动的执行是
非必须的，它的功能更多的可能是调节机体应对损伤、应激时的反应。因此我们也不难理解，在我们的实验结果中，在敲除Gmfb的小鼠中，它的
发育及脑组织大体解剖结构都没有看到明显的差异。微观结构上，敲除Gmfb组小鼠的星形胶质细胞Sholl形态学分析与野生型小鼠的星形胶
质细胞形态分析也无明显差异。在以往的关于GMFB在帕金森、AD等疾病过程发生的参与情况中，有提出GMFB与星形胶质细胞的活化有关的
观点，而星形胶质细胞活化它不是一个单一的过程或现象，它包括了许多复杂的环节[10,14,40]。每一个环节都有可能受到调控。我们的
实验结果发现TBI后野生型小鼠中星形胶质细胞的复杂性降低，在距离星形胶质细胞胞体5-30微米处的细胞突起分叉数目减少。而在敲除Gm
fb的小鼠中，创伤性脑损伤后其损伤部位周围大脑皮层中的星形胶质细胞的复杂性并不发生显著改变。简而言之就是创伤性脑损伤后GMFB可以
调控星形胶质细胞活化后细胞突起分支数目的变化，尤其是在靠近星形胶质细胞胞体部位细胞的突起分支数目会减少。第4章 GMFB促进胶质
瘢痕形成过程中星形胶质细胞的极性改变4.1 实验材料4.1.1 实验动物本章实验中所使用的到的动物同第三章。4.1.2 实验
器材名称公司产地自由落体脑损伤模型击打器安徽正华生物 中国 化学发光仪宝特科技中国冰冻切片机徕卡（Leica）德国刀片徕卡（Lei
ca）德国暗盒凯圳 中国24孔板康宁美国1.5mL离心管 Axygen公司 美国水平摇床 Orbital公司 德国LSM
980共聚焦显微镜蔡司德国精密电子秤Sortorius公司 德国小鼠恒温垫 耀坤 中国PVDF膜 默克Millipor
e 德国载玻片 世泰 中国盖玻片 世泰 中国玻璃分针 双玉 中国移液枪 Gilson公司法国4.1.3 主
要实验试剂名称公司产地碘伏消毒液 上海利康公司中国PBS粉末雷根生物 中国蔗糖Biofroxx公司 德国OCT包埋剂美国樱花
美国封闭山羊血清原液北京索莱宝科技有限公司 中国Triton X-100 中杉金桥 中国兔GFAP抗体Genete
x 美国鼠NeuN抗体Proteintech中国鼠红色荧光二抗艾比玛特 中国兔绿色荧光二抗艾比玛特 中国DAPI碧云天公司
中国4.2 实验方法4.2.1 脑组织取材固定及标本制备本章节实验主要使用的是冰冻标本，脑组织取材和固定方法同上一章。4.2.
2 免疫荧光1、编号、洗涤：将24孔板中的漂片依次进行编号和标记，用PBS洗涤3遍，每遍5分钟，洗去包埋剂。2、封闭及通透：使用
PBS稀释封闭液原液，配制成3%的BSA封闭液，同时向配制好的BSA封闭液中加入Triton X-100，使其浓度为0.3%。将孔
板中的PBS吸尽，向每个孔中加入200 μL封闭通透液，保证封闭液覆盖脑组织，室温下在摇床上缓慢摇晃封闭15分钟。3、洗涤：将封闭
液吸尽，再次用PBS洗涤3遍，每遍5分钟。4、一抗孵育：加入GFAP兔一抗溶液（按1:200配制）或NeuN鼠一抗（按1:200配
制）在4℃冷室摇床上孵育48小时，注意孵育时用封口膜将孔板周围间隙封住，以免一抗溶液蒸发。5、二抗孵育：一抗孵育结束后，回收一抗。
使用PBS清洗标本5分钟，共清洗3遍。吸尽孔板中PBS，按照一抗种属来源加入对应的兔荧光二抗或鼠荧光二抗，每孔200 μL，室温下
摇床上孵育1 h。6、洗涤：二抗孵育结束后，弃二抗溶液，PBS清洗二抗溶液5分钟，共清洗三遍。7、封片：使用粘附载玻片进行编号，向
每个粘附载玻片上滴一滴饱满的水滴，将孵育好的脑组织切片使用玻璃分针尖端捞起，置于事先滴好的水滴上，待标本平铺于载玻片上后，用枪头吸
走标本周围水分，向每个标本加100 μL 含DAPI的抗荧光淬灭剂进行细胞核的染色及封片。使用共聚焦显微镜进行成像。4.3 实验
结果4.3.1 GMFB促进TBI后星形胶质细胞极性的形成为了明确敲除Gmfb对星形胶质细胞在损伤进一步发展过程中的作用，我们对
创伤性脑损伤造模后5天的脑组织进行了GFAP免疫荧光染色。免疫荧光结果显示，在创伤性脑损伤后5天，野生型小鼠脑组织损伤部位周围星形
胶质细胞表现出显著的极性，星形胶质细胞的突起主要朝向损伤部位。而在敲除Gmfb组小鼠的脑组织中，损伤部位周围的星形胶质细胞无显著的
极性，其突起可朝向各个方向。（A）Figure 4-1 knockout of Gmfb abolished polarity o
f astrocytes 5 days after traumatic brain injury. A: GFAP immunof
luorescence staining was performed on the brain tissue of wild-ty
pe mice and homozygous mice 5 days after traumatic brain injury.
Left column,low magnificatio. Scale bars:100μm. The right column
is a higher magnification image. Scale bars:10μm. The dotted line
box in the low magnificatio represents the site of the high magn
ificatio.图4-1 Gmfb的敲除使创伤性脑损伤后5天星形胶质细胞的极性缺失。A：对野生型小鼠、纯合子小鼠创伤性脑损伤后5
天的脑组织切进行GFAP免疫荧光染色。左列为低倍镜图像。图像标尺：100μm。右列为低倍镜图像。图像标尺：10μm。低倍镜图像中的
虚线框代表高倍镜图像截取部位。4.3.2 敲除Gmfb使损伤后神经元存活数目增多为了明确星形胶质细胞极性改变对神经系统损伤修复的
影响。我们对创伤性脑损伤造模后14天的小鼠脑组织进行了GFAP与NeuN免疫荧光双染色。免疫荧光结果显示，在创伤性脑损伤后14天，
野生型小鼠脑组织损伤部位处NeuN阳性细胞数目更多（图4-2 A）。(A)Figure 4-2 A greater number
of neurons survived in the Gmfb knockout group at 14 days after T
BI. A: Immunofluorescence double staining of GFAP (green) and Neu
N (red) at 14 days after traumatic brain injury.The left panels a
re the wild ，and right panels are the Gmfb konckout group.Scale b
ars:20μm.图4-2 敲除Gmfb组在创伤性脑损伤后14天存活神经元数目更多。A：创伤性脑损伤后14天GFAP（绿色）与N
euN（红色）的免疫荧光双染色。左边一列代表野生型，右边一列代表Gmfb敲除组。图像标尺：20μm。4.4 结果分析星形胶质细胞
复杂性的改变只是星形胶质细胞活化过程的一个环节，在这个过程中星形胶质细胞还会有进一步的改变。课题组前期研究发现，敲除Gmfb会使斑
马鱼端脑中放射状星形胶质细胞的GFAP纤维呈现出杂乱无序的排列[32, 44]。这提示高表达水平的GMFB参与了指引星形胶质细胞在
脑组织中排列方向。我们以此为突破口，对损伤后5天的脑组织进行了GFAP免疫荧光染色，对星形胶质细胞的形态观察发现，损伤后5天，野生
型小鼠损伤部位周围有许多长突起状的星形胶质细胞，突起的方向主要指向损伤部位，这被称之为细胞极性[50, 51]。而在敲除Gmfb小
鼠脑组织损伤部位周围星形胶质细胞呈现出无方向性。星形胶质细胞的这种方向性改变在病理状态下发生着的作用，根据既往研究报道，它主要是使
星形胶质细胞在神经系统损伤修复过程中可以形成一个指向损伤部位、栅栏样的星形胶质细胞瘢痕，胶质瘢痕一方面可以将局灶病变包裹起来，限制
损伤部位的炎症向周围扩散。另一方面，星形胶质细胞胶质瘢痕形成后会抑制局灶损伤部位神经元轴突的再生。因此为了研究GMFB引起的星形胶
质细胞的这种改变对损伤后神经系统的修复的影响，我们也进行了GFAP与NeuN免疫荧光双染色，观察发现在敲除Gmfb的小鼠脑组织切片
中存活的神经元数目更多。第5章 GMFB与Arp2/3结合调控星形胶质细胞的细胞骨架排列方式5.1 实验材料5.1.1 实验
细胞本实验使用的是脑皮层组织的原代星形胶质细胞，分别对出生24小时以内的野生型及Gmfb敲除小鼠进行脑组织原代星形胶质细胞培养。采
用到的方法主要是依据先前报道的方法[56]，对本课题组的原代星形胶质细胞提取方法进行改良，从而进行原代星形胶质细胞的提取和纯化。5
.1.2 实验器材名称公司产地37℃细胞培养孵箱Panasonic公司 日本水平摇床Orbital公司 德国粘附载玻片世泰 中国
暗盒凯圳 中国24孔板康宁 美国6孔板康宁 美国移液枪Gilson公司 法国 体式显微镜蔡司 德国LSM980共聚焦显微镜蔡
司 德国倒置显微镜奥林巴斯（IX71） 日本细胞爬片威佳生物有限公司 中国恒温震荡培养箱上海智城分析仪器制造有限公司 中国5m
L无菌滴管Sorfa公司 中国15mL离心管Sorfa公司 中国T75培养瓶Sorfa公司 中国5.1.3 主要实验试剂名称公司
产地碘伏消毒液上海利康 中国PBS粉末雷根生物 中国4%多聚甲醛雷根生物中国封闭山羊血清原液北京索莱宝科技有限公司中国鼠GMFB抗
体 Proteintech公司中国兔Arp2/3抗体genetex公司美国Triton X-100中杉金桥中国488标记的山羊抗兔
IgGAbmrrt公司中国594标记的山羊抗鼠IgGAbmrrt公司中国含DAPI抗荧光淬灭剂碧云天公司中国鬼笔环肽Sigma公司
美国Hanks缓冲液吉诺生物医药科技有限公司中国0.25%含EDTA胰酶 Gibco公司美国DMEM/F12培基Gibco公司美国
胎牛血清Gibco公司 美国无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS） Gibco公司美国拉春库林B（latrunculin B） Abcam
公司 英国5.2 实验方法5.2.1 原代星形胶质细胞的提取培养在分离星形胶质细胞前对体式显微镜及器械进行消毒，环境进行紫外照
射。取出生后24小时内的C57小鼠，用75%酒精消毒，左手拿小鼠，不停喷酒精，特别是颈部皮肤要进行彻底消毒。消毒完毕后用大剪刀断头
；再换小剪刀沿矢状线剪开小鼠头皮，暴露颅骨，换新的剪刀沿颅骨矢状缝剪开颅骨，弯镊剥开颅骨暴露脑组织；用精细镊取出完整大脑，将完整大
脑放入在冰上的装有Hanks液的中皿之中，保证脑组织完全浸泡在Hanks液中，一般一个中皿加入6-7毫升Hanks液；将中皿置于体
式显微镜下，调整合适的视野，使用精细镊依次分离中脑、嗅球、皮质，剥离皮质内部的海马，再继续剥离脑膜、血管等；接下来的步骤在生物安全
柜中进行。将Hanks液中已分离好的脑组织转移至另一中皿中，用手术刀片来回划组织5min，划碎后向皿中加入浓度为0.25%的含ED
TA的胰酶3 mL和3 mL的Hanks液,盖上盖子，放于37℃细胞培养箱中消化15 min。将消化好的细胞拿出来，转移至50 m
l离心管中，加入6 ml含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，在振荡器上震荡1分钟混匀。依次使用70目和20目的滤网进行过滤。最后
得到的滤液放置到离心机中以1000 rpm的速度离心，离心5 min。取出离心管，弃上清，加入9 ml含20%胎牛血清的完全培养基
培养基，吹打混匀，得到细胞悬液，将细胞铺于T75中，37℃孵育。24小时内换液，将20% FBS完全培养基更换成12% FBS完全
培养基，视细胞生长情况，每2-3天更换一次培养基，更换培基时可采用振荡法洗涤细胞，以去除死细胞和漂浮的部分小胶质细胞；5-7天后待
细胞长满时在震荡摇床上以200 rpm的速度震荡7小时分离小胶质细胞；弃培养基后用无菌PBS洗涤细胞3次，进行消化传代，每次消化时
间约3分钟，需在37℃细胞孵箱中进行消化。细胞一般培养到第3代，即第19-21天时就能用于实验。5.2.2 细胞的鬼笔环肽染色种
爬片：将消化下来的细胞以2.5×105的密度种于铺好爬片的24孔板中，摇匀后置于37℃孵箱中进行孵育；固定：24-36小时后可用4
%多聚甲醛固定，此时细胞一般长至40%-50%。固定10分钟后用PBS洗涤3遍，每遍5分钟；通透：弃PBS后在室温下用0.1%tr
iton X-100通透10 min；封闭：弃通透液，PBS洗涤3遍，每遍5分钟。2% BSA封闭30 min，室温下进行；鬼笔环
肽染色：封闭结束后使用FITC-鬼笔环肽 (1:200)孵育1小时，室温下进行；封片：PBS洗涤三遍后，将爬片取出，在载玻片上加7
0 μL含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，有细胞的一面朝向载玻片。5.2.3 细胞免疫荧光种板：将原代星形胶质细胞以2.5×105的
密度铺到放置好爬片的24孔板中，铺板要均匀，放置到37℃孵箱进行孵育；固定：待细胞长到60-70%时在培养板中将已爬好细胞的玻片用
PBS 洗涤 3 次，每次 5 min；用 4% 的多聚甲醛固定爬片 10 min， PBS 再次浸洗爬片 3 次，每次 5 m
in；通透：0.1%Triton X-100室温通透 15 min, PBS 浸洗玻片 3 次，每次 35 min;封闭：吸干
PBS，在爬片上滴加2%BSA封闭液，室温封闭 30 min；一抗孵育：吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿
盒（GMFB按体积比1:400进行稀释，Arp2/3按体积比1：200进行稀释，GFAP按照体积比1:200进行稀释），4℃ 孵育
过夜；二抗孵育：一抗孵育结束后，PBS洗涤三次，每次5分钟，加荧光二抗室温避光孵育1小时；封片：PBS 浸洗爬片 3 次，每次 5
min，洗净后向盖玻片滴加70 μL含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，将爬片有细胞的一面覆在封片剂上方，完成后即可在共聚焦显微镜下观
察采集图像。 5.2.4 划痕实验（1）操作均在在生物安全柜中进行。首先使用 marker 笔在6孔板背后画横线，每孔至少穿过5
条线，每两条相邻的线间距均匀且互相平行。（2）细胞铺板：在孔内接种约1×106个细胞，待细胞长满后（一般24小时后）开始实验，铺板
时一定要均匀。（3）细胞划痕：使用20uL灭菌枪头尖端，垂直预先画好的孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。（4）划痕结束后，用
PBS洗涤细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的划痕间隙清晰可见，便于观察，然后更换新鲜无血清DMEM/F12培养基。（5）细胞培
养与观察：将细胞放入37℃含5%CO2培养箱中培养。选择在划痕后0d，1d，3d，4d，5d，6d，8d，10d，12d，14d，
16d，18d，等不同时间点取出细胞，在显微镜下观察并拍照记录。在观察到星形胶质细胞融合后即可。5.2.5 拉春库林实验（1）种
爬片：将原代星形胶质细胞以5×105铺到放置好爬片的24孔板中，铺板要均匀，同时放置到37℃孵箱进行孵育；（2）拉春库林处理：待细
胞长到60-70%时，在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 洗涤 3 次，将拉春库林以1 μg/ul的终浓度加入到每个孔板中，分
别留取处理前的、处理后45分钟以及处理后2小时的细胞标本，标记为0分钟、45分钟、120分钟；（3）固定：留取的标本均需用PBS清
洗3遍，之后用 4% 的多聚甲醛固定爬片 10 min， PBS 再次浸洗爬片 3 次，每次 5 min；固定好的标本可浸泡在PB
S中置于4℃冰箱后续使用；（4）鬼笔环肽染色：对野生型及敲除Gmfb组的星形胶质细胞进行鬼笔环肽染色，具体方法同上述；（5）成像：
使用共聚焦显微镜进行成像；5.2.6 使用的软件及分析方法本实验使用Imagej软件对鬼笔环肽染色后的细胞面积进行计算，所获得的
的数据均使用Graphpad Prism进行分析，使用到的统计方法主要是双因素方差分析（two-way ANOVA）。实验结果取数
据的平均值，数据使用均数±标准差来表示，P<0.05时认为结果有统计学义。5.3 实验结果5.3.1 敲除GMFB使星形胶质细
胞中的Arp2/3排列无规则为了明确GMFB对Arp2/3在星形胶质细胞中排列的影响。我们通过对分离纯化培养的星形胶质细胞进行GM
FB和Arp2/3免疫荧光双染色观察发现，在野生型小鼠的原代星形胶质细胞中，Arp2/3在细胞中主要表达于细胞核中，同时在细胞质中
也有表达，它在细胞质中的分布很大程度上与GMFB共定位，沿GMFB的分布排列，排列方式呈现出有规则连续的线状排列。而在敲除Gmfb
小鼠的原代星形胶质细胞中，Arp2/3也主要分布在细胞核中，这与野生型的无差异，但它在细胞质中的排列则与野生型星形胶质细胞截然不同
，呈现出不规则点状排列。（A）(B)Figure 5-1 Irregular arrangement of ARP2/3 in
astrocytes after Gmfb knockout. A: GFAP staining of primary astro
cytes from wild-type mice (left panels) and Gmfb knockout mice (r
ight panels). Scale bars：50μm. B: GMFB (red) and ARP2/3（green） im
munofluorescence staining were performed on primary astrocytes. T
he left panels are wild-type mouse primary astrocytes and the rig
ht panels are Gmfb knockout mouse primary astrocytes. Scale bars：
20μm.图5-1 敲除Gmfb后星形胶质细胞中Arp2/3排列无规则。A：野生型小鼠的（左侧）及敲除Gmfb小鼠的（右侧）原代
星形胶质细胞的GFAP染色。图片标尺：50μm。上面一排是低倍镜图像，下面一排是高倍镜图像。B：对原代星形胶质细胞进行GMFB（绿
色）及Arp2/3免疫荧光染色。左边一列是野生型小鼠原代星形胶质细胞，右边一列是Gmfb敲除小鼠原代星形胶质细胞。图片标尺：20μ
m。5.3.2 GMFB调控细胞骨架排列结构为了观察敲除Gmfb后细胞骨架结构的改变，我们使用鬼笔环肽对星形胶质细胞细胞骨架进行
了标记。使用肌动蛋白解聚剂拉春库林B（latrunculin B）处理星形胶质细胞，对处理后细胞的细胞骨架进行鬼笔环肽标记，通过量
化鬼笔环肽阳性细胞面积比较相同时间内细胞骨架的解聚速度。通过对星形胶质细胞进行鬼笔环肽染色发现，在敲除Gmfb后，星形胶质细胞骨架
呈现出形态短小、排列杂乱（图5-3 A）。我们使用1ug/mL浓度的拉春库林B处理细胞45分钟后，与对照组相比，野生型星形胶质细胞
中仅出现少量球状肌动蛋白聚集体，细胞中细胞骨架还是以纤维状肌动蛋白为主。而敲除Gmfb组小鼠的原代星形胶质细胞中则出现大量球状肌动
蛋白聚集体（图5-3 B）。接下来，我们通过延长拉春库林B处理时间后对星形胶质细胞进行鬼笔环肽染色，并对鬼笔环肽阳性细胞的面积进行
量化发现，敲除Gmfb后星形胶质细胞细胞骨架更快的解聚，在45分钟时细胞面积就已经大幅减小，而野生型小鼠的星形胶质细胞在45分钟时
细胞面积与处理前几乎没有显著差异（图5-3 C）。我们延长拉春库林B的处理时间至120分钟，发现野生型星形胶质细胞的细胞骨架还能进
一步解聚（图5-3 C）。通过在高倍镜下对野生型星形胶质细胞的形态进行观察也发现，在拉春库林处理时间延长到120分钟时，野生型星形
胶质细胞中也出现与Gmfb敲除组处理45分钟时相似的现象，即细胞中有大量肌动蛋白聚集体（图5-3 D）。(A)（B）（C）（D）（
E）Figure 5-2 Changes in cytoskeletal structure of astrocytes aft
er Gmfb knockout. A: Phallioidin staining of primary astrocytes t
o show cytoskeletal arrangement.Scale bars：20μm. B:Phallioidin st
aining after cytoskeletal depolymerization experiment.The left pa
nels show the cytoskeleton morphology of the control group withou
t treatment with latrunculin B, and the right panels show the cyt
oskeleton morphology 45 minutes after treatment with latrunculin
B. The arrow indicates the globular actin aggregates. C:?Wild-typ
e and Gmfb knockout astrocytes were treated with latrunculin B. T
he control group of astrocytes treated with latrunculin B for 45
min and 120 min were stained with FITC-phalloidin B?.Five Wells w
ere set up in each group, and four fields were randomly selected
from each well. Scale bars：100μm. D: Quantitative analysis was pe
rformed on the area of phalloidin positive cells.The analysis met
hod used was two-way ANOVA effect of the time after treated with
latrunculin B for 45min,120min. Time effect,F (1.970, 74.86) = 66
.22, P＜0.0001,effect of genotype,F (1, 38) = 78.53, P＜0.0001，inte
raction,F (2, 76) = 31.53, P＜0.0001.Post hoc Sidak’s test, 45min，
P＜0.0001，120min, P＜0.0001，as compared to Gmfb knoct out group. In
WT group, 45min vs 0min, P=0.7689, 120min vs 0min, P＜0.0001). E:
Higher magnification, the arrow indicates the globular actin agg
regate. Scale bars：10μm.图5-2 敲除Gmfb后星形胶质细胞细胞骨架结构发生改变。A：原代细胞进行鬼笔环
肽染色以显示细胞骨架排列结构。图片标尺：20μm。B：细胞骨架解聚实验后鬼笔环肽染色。左侧列是对照组，即拉春库林B处理之前的细胞骨
架形态，右侧列是拉春库林B处理后45分钟后细胞骨架的形态。箭头所指代表球状肌动蛋白聚集体。图片标尺：10μm。C：细胞鬼笔环肽染色
的低倍镜图片。上面一排代表野生型星形胶质细胞，下面一排代表敲除Gmfb的星形胶质细胞。将野生型及敲除Gmfb的星形胶质细胞予拉春库
林B处理，分别对对照组、处理45分钟、处理120分钟的星形胶质细胞进行鬼笔环肽染色。每组设5个孔，每个孔随机取4个视野进行拍照。图
片标尺：100μm。D：鬼笔环肽阳性细胞面积的量化。数据分析采用双因素方差分析（时间效应，F (1.970, 74.86) = 6
6.22, P＜0.0001,基效应因, F (1, 38) = 78.53, P＜0.0001，交互作用, F (2, 76)
= 31.53, P＜0.0001. Post hoc Sidak’s test，和Gmfb敲除组比较，45min，P＜0.000
1，120min，P＜0.0001. 在野生型组内，45min vs 0min,P=0.7689, 120min vs 0min,
P＜0.0001）。E：高倍镜图片。白色箭头所指为大量球状肌动蛋白聚集体。图片标尺：10μm。5.3.3 敲除Gmfb使体外划
痕实验中星形胶质细胞的迁移速度增快通过对野生型及敲除Gmfb组小鼠的星形胶质细胞进行划痕实验发现，敲除Gmfb组的星形胶质细胞在划
痕实验后16天伤口就已基本愈合，而野生型小鼠原代星形胶质细胞在划痕实验后16天伤口尚未愈合，继续培养至第20天时仅有部分细胞融合。
同时通过对迁移过程中星形胶质细胞的形态观察发现，敲除Gmfb小鼠的星形胶质细胞在迁移过程中迁移前缘大致呈平行状态，愈合时整个伤口基
本全同时被细胞覆盖，而野生型小鼠星形胶质细胞迁移前缘多无规则，以至于在出现局部伤口愈合后，其他区域的划痕之间仍留有较大间隙。（A）
（B）（C）Figure5-3. A: Representative images of wild-type primary as
trocytes 1-20 days after scratch experiment.B: Gmfb knock out gro
up representative images 1-16 days after scratch experiment of pr
imary astrocytes .White dotted line marks the leading edge of mig
rating cells, and the arrow points to the site of wound healing.C
: Schematic diagram of cell migration in the WT group and the Gmf
b knock out group.图5-3.A.野生型原代星形胶质细胞划痕实验后1-20天的代表性图像。B：Gmfb敲除组原代星
形胶质细胞划痕实验后1-16天的代表性图像。白色虚线标记迁移的细胞的前缘，箭头指向伤口愈合的部位。C：WT组及Gmfb敲组细胞迁移
示意图。5.4 结果分析在既往的研究报道中，GMFB在细胞生命活动中参与到细胞骨架排列的调控，是一个细胞骨架去分支因子，发挥这一
功能主要是通过与Arp2/3结合，减少细胞骨架分支形成以达到去分支的作用[45]。我们的实验发现，野生型小鼠的星形胶质细胞中Arp
2/3与GMFB共定位，在细胞中是有规则排列的，而敲除Gmfb后Arp2/3在细胞质中呈无规则分布，这提示GMFB参与到了Arp2
/3在细胞中的分布排列。通过对细胞骨架的鬼笔环肽染色我们发现，敲除Gmfb后星形胶质细胞的细胞骨架呈现出形态及排列的改变。结合敲除
Gmfb后Arp2/3在细胞中的分布的改变及既往的研究报道，我们推测，GMFB在星形胶质细胞中可能是通过与Arp2/3结合，在细胞
骨架上特定的部位减少细胞骨架分支的形成，当敲除Gmfb后，细胞中的Arp2/3无GMFB与之结合，因此在细胞骨架组装过程中形成许多
分支。拉春库林B是一种得自红海棉的高毒大环内酯，它的主要作用机制是与细胞中细胞骨架解聚下来的球状肌动蛋白（G-actin）螯合，阻
止纤维状肌动蛋白（F-actin）组装，可以在体外影响肌动蛋白的聚合，正常生理状态下肌动蛋白的解聚与聚合是一个稳态平衡状态，拉春库
林B打破了这一生理状态，以达到一个促解聚的效果。我们使用拉春库林B处理星形胶质细胞后，对细胞骨架进行染色发现，以相同浓度处理相同时
间的星形胶质细胞，敲除Gmfb组较野生型星形胶质细胞的细胞骨架解聚更快速。在延长拉春库林B处理后，野生型小鼠星形胶质细胞的细胞骨架
还能进一步解聚。我们结合这一结果进一步推测敲除Gmfb使星形胶质细胞的细胞骨架分叉更多，更短小，因此在解聚过程中，其细胞骨架可以有
多个解聚的起点，在相同时间内多个细胞分支同时解聚，解聚下来的球状肌动蛋白更多，也就形成了我们所能观察到的球状肌动蛋白聚集体。 我们
通过划痕实验观察到敲除Gmfb小鼠的星形胶质细胞迁移速率更快，而星形胶质细胞的迁移活动中主要依靠细胞骨架的不断解聚和聚合，因此我们
可以根据这一结果推测敲除Gmfb后细胞骨架解聚更快，进一步印证我们推测的敲除Gmfb后细胞骨架排列模式的改变（图5-3）。而关于敲
除Gmfb小鼠星形胶质细胞迁移前缘的局部无明显突出，我们推测可能是由于在失去GMFB的去分支作用，细胞骨架组装过程中形成较多分支，
作为细胞的支架在推动细胞迁移的过程中没有固定突出的方向，因此星形胶质细胞迁移前缘大致平行，无明显突出。Figures 5-3 T
he cytoskeleton pattern diagram图5-3 细胞骨架模式图第6章 全文总结与讨论目前创伤性脑损伤具
有较高发病率、致死率、致残率，但其尚缺乏行之有效的治疗方法。在创伤性脑损伤后，星形胶质细胞参与到星形胶质细胞瘢痕的形成过程中，这对
损伤后修复的过程极为重要。而在瘢痕形成过程中影响它的因素众多，找到星形胶质细胞瘢痕形成的影响因素能为寻找损伤后修复的调控靶点提供理
论依据。本课题组研究发现GMFB在创伤性脑损伤后表达水平升高，这种表达水平的升高的改变先于星形胶质细胞活化的出现，且GMFB会在损
伤脑组织中的GFAP阳性细胞中表达，这就表明损伤后GMFB对星形胶质细胞的活化可能有促进作用。既往的研究表明，在胚胎发育时期，GM
FB在脑组织中处于一个较高的水平，而在器官发育成熟后GMFB回落到较低的表达水平[32]，这提示GMFB可能对神经系统的发育起着至
关重要的作用。GMFB对机体的作用如此重要，但我们在小鼠的生长发育、大脑解剖结构及星形胶质细胞的形态中没有观察到显著差异，我们认为
可能是由于在发育过程中GMFB作为细胞骨架去分支因子，它的作用被细胞内其他细胞骨架去分支因子所代偿，因此才出现我们观察到的解剖结构
未见显著差异。病理损伤情况下，GMFB的表达水平升高，星形胶质细胞复杂性降低，而敲除Gmfb后损伤后星形胶质细胞的复杂性改变不明显
，这提示GMFB可以降低损伤后星形胶质细胞的复杂性。损伤发生后野生型星形胶质细胞突起分支数目的减少主要发生在距离胞体较近的部位，在
靠近星形胶质细胞胞体处发出的分支多是星形胶质细胞主干的分支。在损伤后进一步进展过程中，我们观察到野生型小鼠脑组织中星形胶质细胞极性
改变，它主要表现为细胞突起较长，较长的细胞突起方向朝向损伤部位。因此我们认为GMFB引起的星形胶质细胞复杂性的改变在星形胶质细胞胶
质瘢痕形成进展中可能主要影响了星形胶质细胞极性的改变。因为突起分支数目越多，越难形成具体方向，而突起分叉数目越少，越容易形成具体的
方向，细胞的极性也越明显，越容易在损伤部位周围形成如同先前文献报道过的栅栏样的星形胶质细胞瘢痕[50, 51]。星形胶质细胞极性改
变带来的进一步影响，我们也通过对神经元的标记染色观察到，敲除Gmfb的小鼠在损伤后14天脑皮层中神经元存活的数目更多。既往有文献报
道在敲除Gmf后，尼氏染色后观察到丢失的神经元减少[48]，这是否提示敲除GMFB对损伤后神经元修复是有益的，我们认为这是仍待进一
步探索的，因为从数量上来说神经元丢失的数目减少，但是神经元发挥正常的神经功能并不是依靠单一的神经元完成，因此但这些神经元是否能发挥
正常的生理功能尚不明确。同时我们认为，在损伤后脑组织中GMFB表达水平升高的模式实质上是在打破机体脑内稳态之后，脑组织损伤修复过程
会进入到一个类似脑发育过程的状态的表现。因此我们推测，在损伤修复过程中，GMFB表达升高引起的星形胶质细胞极性增强可能会引导着神经
损伤后正确的修复，虽然极性增加形成的胶质瘢痕将会抑制神经元轴突的再生，但也许就是这种模式调控下的损伤修复的神经元才能发挥正常生理功
能。GMFB在细胞中主要参与细胞骨架去分支的调节，而其在细胞中发挥细胞骨架去分支这一作用时主要是通过与Arp2/3结合[45, 4
6]，GMFγ曾在迁移的细胞前缘被检测到与Arp2/3免疫共沉淀[57]。我们的实验结果显示敲除Gmfb后原代星形胶质细胞质中Ar
p2/3失去了GMFB的结合，在细胞中排列无规则。在敲除Gmfb后星形胶质细胞的细胞骨架形状短小，分支较多，排列杂乱。这提示GMF
B与Arp2/3的结合调节Arp/3的分布可能调控细胞骨架的排列。在使用拉春库林对星形胶质细胞进一步处理后发现，敲除Gmfb的星形
胶质细胞细胞骨架解聚速度更快，这也进一步证明敲除Gmfb后星形胶质细胞细胞骨架形态形成更多的分支，因为细胞骨架在细胞生命活动中持续
的解聚和聚合，维持动态平衡，因此我们推测敲除Gmfb后细胞骨架解聚更快的原因是因为星形胶质细胞细胞骨架分叉数目多，其相比野生型星形
胶质细胞的细胞骨架，在细胞解聚时有更多解聚的起点，在相同时间内可以更快的解聚。在体外星形胶质细胞划痕实验中，敲除Gmfb的星形胶质
细胞在损伤后的迁移过程中迁移速度更快。星形胶质细胞的迁移过程是依靠细胞骨架不断解聚和聚合的过程，敲除Gmfb细胞骨架分支多，解聚效
率高，因此迁移的也就更快。在划痕迁移前缘的细胞形态观察中，敲除Gmfb后的星形胶质细胞在损伤修复过程中两前缘大致平行，很少有迁移前
缘局部的细胞突出，野生型星形胶质细胞在愈合时则可以形成局部先愈合，这可能是因为野生型的细胞骨架结构的分支少，在迁移时细胞骨架主干可
以在局部形成突出，使细胞迁移时有方向性，而敲除Gmfb后细胞骨架多分支，可以有朝向每个方向的细胞骨架解聚及聚合，表现出无明确方向，
细胞局部无突起。这也可以解释我们在体内观察到野生型星形胶质细胞在损伤后有显著极性，而敲除Gmfb星形胶质细胞则没有这一特点。也是因
为当损伤后，GMFB表达增多，GMFB与星形胶质细胞中更多的Arp2/3结合实现减少细胞中细胞骨架分支，使细胞骨架的主干更长，这时
星形胶质细胞也就形成更长的突起，表现为我们观察到的显著的极性。综上我们认为，GMFB可能是通过与Arp2/3结合减少细胞骨架的分支
形成，在细胞活动中调控了细胞的方向性，这种方向性的改变在体内主要体现在星形胶质细胞的极性升高。通过合理地调控这个靶点控制星形胶质细
胞的极性，也许能引导神经元正确的损伤修复，同时又能减少胶质瘢痕形成对神经元损伤修复的抑制，将会为寻找脑损伤治疗方法提供重要参考。参
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