 细胞过度融合会引起代谢减慢、分裂减少以及接触性生长抑制，进而可能导致细胞数量与药物作用之间失去线性关系。因此，控制实验起始时活细胞数量对于实验成功进行至关重要。台盼蓝拒染是选择性区分活死细胞最常用的方法。染料带负电，只能在细胞膜被破坏（死亡细胞膜通透性增加）时才能对细胞进行着色，健康细胞无色。但是该方法无法区分功能正常/丧失的活细胞。测定方法：含0.4%（w/v）台盼蓝的PBS（pH 7.2）溶液20 μL与经/未经处理的巨噬细胞悬液20 μL混合，取10 μL加至计数板和盖玻片空隙中，5 min内进行计数，计算细胞存活率。处于对数生长期的细胞存活率至少为95%，可用于后续进一步实验。  人们于1983年首次描述了MTT法检测细胞活力，该方法基于活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能够还原黄色水溶性MTT生成深蓝色或紫色不溶性的formazan。方法的局限性在于最终产品formazan晶体会损伤细胞，需要用有机溶剂（DMSO或HCl/异丙醇）进行溶解。结果测定时，向每个孔中加入20 μL MTT溶液（培养基或PBS配制：5 mg/mL），使最终浓度为0.5 mg/mL。37°C培养4 h后，弃上清液并加入150 μL DMSO充分振摇溶解，测定570 nm处的吸光度值。或者，可以加入50 μL MTT终止液（三联溶解液：SDS 10 g 异丁醇 5 mL 10 M HCl 0.1 mL用双蒸水溶解配成100 mL溶液）代替DMSO，过夜培养24 h后，使用微孔板读取器测定570 nm处吸光度值。 MTS也称为欧文试剂，是一种与MTT密切相关的弱酸性内盐，毒性相对较小，带负电，不易穿透细胞膜。因此，该试剂通常与电子耦合试剂吩嗪硫酸甲酯（PMS）或吩嗪乙基硫酸酯（PES）结合使用。这些中间产物可离开细胞并将MTS转化为在培养基中高度可溶的formazan产物，并且这种转化依赖于代谢活跃细胞中的NADP（H）脱氢酶。通常，在每个孔中加入20 μL含MTS的PES试剂，最终浓度为0.33 mg/mL，孵育2 h后，使用微孔板读取器测定490–500 nm处的吸光度。 WST-1是一种带负电的二磺化内盐，含有碘残基，在NADH和电子耦合体存在下，可在细胞外产生高度水溶性formazan。与传统的四氮唑盐相比，WST-1及其formazan在溶液中非常稳定，并且细胞毒性极低。迄今为止，WST系列中已经开发了几种其他四唑盐，其中最有用的可能是WST-8，即CCK-8。由于WST-8、formazan产品和PMS在细胞培养基中没有细胞毒性，因此检测结束后细胞还可用于其它实验（但一般不推荐继续使用，除非细胞极难获得）。通常，将20 μL WST-1或10 μL CCK-8添加到每个孔200 μL反应体系中，并在37°C培养4 h后测定450 nm的吸光度值。 XTT含有两个磺酸基团，带负电，无法自由穿透细胞膜。在电子耦合试剂存在的情况下，XTT能够被线粒体内的一些与辅酶Ⅱ相关的脱氢酶还原生成水溶性的橘黄色formazan，生成的formazan量与活细胞数量成正比，并且formazan能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。 Alamar Blue的活性成分resazurin （刃天青）是一种无毒、可透膜的蓝色染料，有微弱的荧光性，它作为一种氧化还原指示剂，被细胞内吞后，在细胞质中被以上这些代谢中间体还原，其还原产物resorufin呈现出粉红色并有很强的荧光性，最后可用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比，因而可作为细胞增殖和细胞毒性定量检测的一个理想的指示器。Alamar Blue 细胞活力试剂具有广泛的适用性，可用于各种人和动物细胞系、细菌、植物和真菌的细胞活力检测。
结晶紫染色最初用于单层培养细胞数量的检测，是一种简单的非酶测定法，用于快速分析具有活性的粘附细胞及菌落数量。该方法基于结晶紫染料与DNA双螺旋外表面之间的亲和力。缺点在于，结晶紫也能对死细胞进行非特异性染色。测定方法：经/未经处理后的巨噬细胞用PBS洗涤后在37°C下与含有2%（v/v）乙醇-0.2%（w/v）结晶紫的PBS溶液孵育30 min。孵育结束后用PBS洗涤，以33%（v/w）乙酸溶解结晶紫，使用微孔板读取器测定540 nm处的吸光度值。 将巨噬细胞（1×106细胞/mL）接种在6孔板中并给予特定条件的刺激。刺激结束后，细胞用PBS洗涤并收集。然后将它们固定在70%冰乙醇中（固定至少4 h，固定时先用300 μL PBS重悬细胞，缓慢滴入700 μL冰无水乙醇中，减少细胞成团）。固定结束后，PBS洗涤细胞，再悬浮在含有50 U/mL RNA酶和50 μg/mL碘化丙啶（PI）的1 mL PBS中，然后在4°C条件下避光孵育40 min，通过流式细胞仪进行细胞周期分析，并计算不同阶段的细胞数量。 在遇到刺激以后，巨噬细胞会发生一系列形态学变化，比如细胞大小增加，产生丝足（含有肌动蛋白丝）或板足（带有肌动蛋白尖峰）。因此，细胞形态学的变化可以指示巨噬细胞功能的激活或抑制。
巨噬细胞在12孔板或者6孔板中给予特定条件刺激后，用PBS洗涤细胞，然后直接使用DAPI（1 μg/mL的PBS溶液）染色15 min；或者使用DiOC6与DAPI同时进行染色。此外，细胞也可以经4%多聚甲醛室温固定15 min后DAPI染色（300 nmol/L）30 min。通过荧光显微镜观察细胞及核形态。
巨噬细胞在24孔板或者6孔板中给予特定条件刺激后，用PBS洗涤细胞，随后在2-2.5%的戊二醛-0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中固定过夜，PBS洗涤3次后用1%四氧化锇固定2 h，PBS洗涤3次。随后细胞置于梯度浓度的乙醇中进行脱水处理（通过脱水清除游离水可以使包埋剂均匀渗透），并在临界点干燥器中干燥，经喷金处理后可进行电镜观察。对于透射电镜和扫描电镜观察，细胞的前处理方式并不一致，不过一般我们做电镜观察都是送外包的啦。 对于巨噬细胞吞噬功能的评价，我已经在PBMC系列之——巨噬细胞知识合集，鼠巨噬细胞的体外分离与培养（二）一文中为大家做了详细的阐述，本期就不再重复啦。 胞饮过程是另一种方式的内吞过程，通过该过程，巨噬细胞可以从周围介质中吸收液体或者其它物质。将巨噬细胞以2×104个细胞/mL的密度接种至96孔板，贴壁培养6 h后进行刺激处理。刺激结束后，弃旧培养液，每个孔中加入100 μL的0.075-0.1%的中性红溶液（PBS或培养基配制），孵育1-2 h后，PBS洗去多余染色液。然后在每个孔中加入100-200 μL的细胞裂解液（乙醇：乙酸v/v=1:1或乙醇：1 mol/L乙酸=1:1或1%冰乙酸：乙醇=1：1或1%乙酸溶液：50%乙醇=1∶1），并将混合物在室温下培养4 h或过夜。最后使用微孔板读取器测定540 nm处的吸光度值[3]。胞饮活性可用胞饮指数进行评价。  Ca2 是细胞内普遍存在第二信使，参与免疫细胞多个生命活动过程的调节，包括趋化、粘附、促炎/抗炎细胞因子分泌等。静息态细胞Ca2 浓度大约在100 nM，细胞受刺激后浓度可升高至1μM。内质网释放的Ca2 可以激活血浆和/或吞噬体膜，导致胞质Ca2 迅速升高，可促进部分吞噬受体对外来颗粒的摄取，并且参与调节吞噬体成熟、周围肌动蛋白网溶解、吞噬体与含有溶解酶颗粒物的融合以及NADPH氧化酶复合物（可生成超氧化物）激活等后续过程。此外，胞质Ca2 水平升高反过来还可作用于AP-1、STAT1/3等转录因子，促进促炎靶基因的表达。细胞内Ca2 水平与巨噬细胞的活性密切相关，因此可以通过Ca2 水平检测来部分评价巨噬细胞的活性。 Fluo-4是一种动态单波长荧光Ca2 指示剂，荧光强度的增加反映了细胞质Ca2 水平的升高。将巨噬细胞接种在96孔板中，经条件刺激处理后移除培养基，然后将细胞与100 μL染料负载溶液孵育30 min，检测荧光强度（Ex/Em=485/535 nm）。结果也可通过流式细胞术进行评价。  图注：该图是对胞质Ca2 进行的动态检测，图片来源[4]
 ROS对巨噬细胞的抗菌活性具有重要作用。在病原体识别和吞噬后，NADPH氧化酶（NOX）的胞质亚单位被磷酸化并迁移到吞噬体膜上，形成具有膜结合亚单位的功能酶。NOX完成组装后，随即吞噬体内产生大量的超氧化物自由基（O2·—），该“氧化爆发”过程可长达2 h。最终，巨噬细胞胞浆中产生的NO会穿过吞噬体膜与超氧阴离子发生反应，产生活性氮（RNS），其中包括过氧亚硝酸盐（ONOO—）。这些氧化剂可诱导亚硝化应激，促进ROS产生，并且能够杀死微生物。炎症细胞释放的ROS能够通过多种方法进行测量。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光即可知道细胞内ROS水平。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可用激光共聚焦显微镜直接观察。测定方法：去除经/未经处理的巨噬细胞的上清液，PBS洗涤后，在37°C下用10 μM DCFH-DA（无血清培养基配制）染色20 min，随后选用合适的方法进行检测。 细胞内ROS也可以通过检测CM-DCFH氧化产物CM-DCF的荧光强度来测量。测定方法：除经/未经处理的巨噬细胞的上清液，收集细胞并用PBS洗涤，细胞随后与10 mM CM-DCFH在室温条件下孵育30 min，测定Ex/Em=485/530 nm处的荧光强度。 二氢罗丹明123（DHR 123）是一种非荧光且不带电荷的ROS指示剂，可扩散穿透细胞膜，进入细胞后被氧化为阳离子的罗丹明123，定位在线粒体上，发射亮绿色荧光（Ex/Em=500/536 nm）。单一的NO、超氧化物以及过氧化氢都不能氧化DHR 123，但是当这些ROS与其他细胞组分比如细胞色素C氧化酶或者Fe2 联合起来能够氧化DHR 123生成荧光衍生物罗丹明123。测定方法：将DHR 123添加到含有经/未经处理的巨噬细胞中（10 μM/孔），并在室温下孵育15–30 min，通过荧光分光光度计分析荧光强度。 将巨噬细胞（2×105细胞/mL）接种在96孔板上并给予特定的条件刺激。刺激结束后将细胞进一步与200 μL含有0.1%硝基蓝四氮唑（NBT）和2 μg/mL PMA的PBS溶液在37°C下孵育30 min。此时，吞噬细胞内产生的超氧阴离子能够还原水溶性淡黄色的NBT生成蓝色的 formazan，以折光性强的点状或斑块状颗粒沉积于细胞内。随后加入80 μL 70%甲醇终止反应并干燥细胞，最后加入2M KOH（120 μL）以及DMSO（140 μL）溶解formazan，读取620/10 nm处的吸光度值。 过氧化氢（H2O2）是活性氧的主要成分，是一种不带电、稳定且可自由扩散的第二信使。吞噬细胞发生氧化应激时，超氧化物歧化酶（SOD）1和2可利用超氧化物产生H2O2。虽然超氧化物很难穿过细胞膜，但H2O2很容易在胞内外进行扩散。当H2O2扩散至细菌细胞质时可能诱导多种分子损伤。此外，细胞内H2O2还能够触发下游信号通路，促进促炎细胞因子的产生。检测方法：经/未经处理的巨噬细胞中加入100 μL含过氧化物酶的酚红缓冲液中（5 mM葡萄糖、0.56 mM酚红溶液和8.5 UI/mL HRP），在37°C下培养1 h后，加入10 μL 1 M NaOH终止反应，然后读取620 nm处吸光度值。H2O2的浓度可根据H2O2的标准曲线确定。 溶酶体在巨噬细胞的吞噬过程中具有重要作用，巨噬细胞利用吞噬体将细菌内化，被吞噬的细菌将被转移至内吞溶酶体中进行酶催化降解，溶酶体对细菌的降解维持巨噬细胞对细菌的吞噬。巨噬细胞富含溶酶体酶，如酸性磷酸酶（ACP）、非特异性酯酶、溶菌酶等，测定这些酶的活性也是衡量巨噬细胞功能的实用指标之一。ACP能分解β-甘油磷酸钠释放出磷酸基，后者与硝酸铅（捕捉剂）反应产生无色磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），而磷酸铅再与硫酸铵反应则形成黑色硫化铅（可在光镜下观察），沉积在胞浆内酸所在处，显示棕黑色颗粒。测定方法：经/未经处理的巨噬细胞去除上清液，加入25 μL Triton X-100（1%）和150 μL对硝基苯基磷酸盐溶液（1 mg/mL），混合物在室温孵育1 h，并加入50 μL NaOH溶液（3 M）终止反应，读取405 nm处吸光度值。
转录水平检测受体分子的mRNA表达水平。 通过使用受体特异性抑制剂来评价该受体在特定生物学过程中的作用。 转录组分析的缺点之一是mRNA的存在并不总是精确地反映蛋白质水平，许多蛋白质在翻译水平还存在被修饰过程，这种局限性可以通过蛋白质印迹法克服。 通过递送21-23个核苷酸的长干扰RNA（siRNA）来实现巨噬细胞靶mRNA降解，用以确定相关受体在特定生物学过程中的作用。受体蛋白干扰成功与否可通过WB确认。 NF-κB是一种关键的促炎因子，可以调节多种调节受体、细胞因子、趋化因子和酶的转录。当巨噬细胞通过多种PRR途径感知病原体时，NF-κB被激活。NF-κB由五个亚单位的同源和异源二聚体组成，即p65/RelA、RelB、c-Rel、p50/NF-κB1和p52/NF-κB2。在静息态细胞中，NF-κB通过与IκB（NF-κB抑制剂）蛋白如IκB-α、-β和-ε结合而定位与细胞质中。受到刺激后，IκB经IκB激酶（IKK）磷酸化后经由泛素-蛋白酶体系统降解，NF-κB二聚体随即移位至细胞核与靶基因启动子以及增强子结合，诱导促炎基因的转录。因此，动态监测NF-κB分布是一种广泛检测转录因子活性的方法。关于NF-κB细胞内分布变化的检测主要通过两种方法：1）细胞核-胞浆分离后使用WB检测细胞核及胞浆中p-NF-κB水平的变化；2）基于图像的NF-κB追踪，通过抗体染色或融合荧光蛋白监测蛋白的动态分布。 免疫荧光分析（IFA）是一种通过抗原-抗体反应检测和可视化细胞中蛋白表达的显微镜技术。 BAY 11–7082（BAY）是NF-κB抑制剂，可用于探究NF-κB介导的信号通路的作用。研究已经证实，BAY可强烈抑制NO、PGE2和TNF-α的产生，同时它还能减少p65移位及其上游信号事件的发生，如IκB-α、IKK和Akt的磷酸化。为了研究信号转导途径，可将巨噬细胞与BAY（1 μM）孵育2 h，然后给予特定条件刺激，最后进行相关检测。 巨噬细胞转染pNF-κB-Luc质粒（质粒包含NF-κB反应区、萤火虫荧光素酶以及抗性基因等），48 h后细胞进行至少一周的抗性基因筛选。接着挑选LPS处理后显示出最强荧光素酶活性的克隆进行扩大培养。细胞构建成功后给予特定条件的刺激，收集细胞并进行裂解（100 μL），然后将20 μL裂解液与100 μL荧光素混合并检测化学发光情况，结果可描述为相对荧光素酶活性（与阴性对照相比的倍数差异）。 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）常用于检测DNA结合蛋白。该技术的原理是蛋白质-DNA复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的移动速度比相应的游离线性未结合DNA慢。这种高灵敏度且操作简单的方法可用于研究DNA和蛋白质相互作用。  注：研究结果表明AZM能够抑制p65的核转移。胞浆和细胞核部分同时应该跑Histone H3以及Actin蛋白，用以证明细胞核-胞浆分离的效果，及两者之间没有相互污染。 细胞因子由多种低分子量蛋白组成，在皮摩尔或纳摩尔水平即可充当促炎或抗炎因子，调节炎症和细胞活动。炎症趋化因子则受炎性刺激产生，并可促进免疫反应。当两者与其配体结合后会引起一系列级联反应以参与细胞功能，包括吞噬、细胞因子分泌、细胞增殖激活等。研究这些信号分子是研究任何炎症反应的基础。巨噬细胞激活后，可通过NF-κB促进 ①多种细胞因子表达：比如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α和GM-CSF；以及 ②多种趋化因子表达：比如IL-8、MIP-1、MCP-1、CCL2、调剂活化正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）、CCL5、eotaxin等；以及 ③诱导型效应酶表达：如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）。此外，NF-κB也能激活其自身抑制剂IκB-α，随后转移至细胞核与NF-κB启动子结合，终止NF-κB诱导的转录激活，最终IκB-α以失活态返回细胞质。总的来说，NF-κB是一种发挥作用迅速的转录因子，可调节宿主感染早期的先天免疫应答，并与慢性炎症和多器官衰竭相关。目前，有多种方法可用于检测细胞因子，其中以ELISA最为常见。 酶联免疫吸附测定（ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。 IκB-α、p-IκBα（Ser32）、STAT3、p-STAT3（Tyr705）、iNOS、COX-2、p-ERK1/2、SAPK/JNK、TNF-α、IL-1、IL-6、P38、p-P38、ERK1/2、JNK和p-JNK，α-Tubulin、c-jun、c-fos和β-actin等可通过Western印迹法测定。DNA结合蛋白如p38、SAPK/JNK、c-src、AP-1、Ras和Akt等则可通过EMSA测定。（上述罗列的蛋白已经文献验证。） 测定方法：经/未经刺激处理的巨噬细胞用PBS洗涤后，用5%山羊血清封闭细胞表面15 min，或在冰上用含有10%正常小鼠血清的染色缓冲液封闭细胞表面20 min，封闭结束后洗涤两次。随后，将细胞与抗CD80、CD40、CD86和相应荧光标记的单克隆抗体在4°C下孵育约30 min。PBS洗涤后，细胞用1%多聚甲醛固定在PBS中，对固定的细胞进行流式细胞术分析，每个样品至少分析5000个细胞（细胞也可不固定直接上流式检测）。 cDNA微阵列技术可识别特定基因，并允许研究人员比较正常和病理条件下基因的表达谱。简言之，提取经/未经刺激处理的巨噬细胞的总RNA，用于cDNA合成、标记和微阵列杂交。 8. Haydar, D., et al., Azithromycin Polarizes Macrophages to an M2 Phenotype via Inhibition of the STAT1 and NF-κB Signaling Pathways.Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950), 2019. 203(4): p. 1021-1030. 以上就是今天整理的关于巨噬细胞功能评价的所有内容啦，希望大家喜欢，我们下期再见啦！随手点个赞，你的支持就是我坚持的动力。 |
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