【原创】干货大派送！含种植体骨组织切片经验分享

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片

还记得曾经的“含医疗器械植入物组织切片制备和病理阅片经验分享”（点击可查看）吗？为促进毒性病理从业人员间的交流学习，领先医疗病理学老师将为大家分享下含骨组织切片经验。一样的配方，不一样的味道，请记得拿好小本本做笔记噢~

前

言

骨组织切片

骨组织切片是形态学及组织学上研究骨组织行为及骨修复重建过程的重要技术手段之一。骨组织切片既可用脱钙后常规石蜡切片技术，也可用塑料包埋切片技术（常称为硬组织切片），二者互有优劣。石蜡切片需进行骨组织脱钙，适用于小块骨组织，优点是切片和染色速度快；劣势是脱钙时间长、无法区分矿化骨和未钙化的类骨质，尤其不适用于带种植体的骨组织样品。硬组织切片不需进行骨组织脱钙，正好可弥补脱钙对骨切片不利的影响，可用于大块骨组织以及带种植体的骨组织样品；但劣势是制作过程复杂、周期长、技术难度大。随着用于骨缺损或骨组织植入的新材料的不断出现，对硬组织切片的需求也随之增加，如何高效且高质量的制作硬组织切片一直是硬组织切片技术的研究热点。

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如何取材、固定和脱水？

这类组织取材为了观察完整的植入物，则必须将整个植入物连带组织一起取下，且在取材的时候也不方便制成小块样品。

取材的大小决定了固定和脱水的时间，根据组织大小可灵活调整固定及脱水时间。一般用10%多聚甲醛溶液固定不少于24h，大块样品需要延长固定时间。骨组织脱水时，酒精对骨的渗透速率非常低，需延长脱水时间，梯度酒精脱水，每级脱水时间可设置24～72h，也可加压，加快脱水。脱水应彻底，否则会影响后续的树脂渗透。骨组织透明可选择氯仿或者二甲苯，氯仿透明速度慢，但组织收缩小，相对而言二甲苯的透明效果显而易见，但对组织收缩作用较大，实际操作中可视组织大小而定。相对来说，如果是大块组织，选择二甲苯透明，以得到较好且快速的透明效果或许是个更好的选择。

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包埋的方式如何选择？

不脱钙骨组织，一般常用环氧树脂或甲基丙烯酸酯类进行包埋。在此我们分享下甲基丙烯酸酯的使用经验。

目前使用较多的包埋液主要有三种情况：1.甲基丙烯酸甲酯单独使用；2.甲基丙烯酸甲酯与邻苯二甲酸二丁酯混合使用；3. 甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸丁酯混合使用。

根据本实验室多年使用经验，对比认为第三种包埋方法制得切片质量最好。无论第一、二哪种方式，都存在切片过硬且易脆的缺点，这在大块组织制片过程中造成很大的困难，难以保证样品的完整性。而以甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯作为包埋液，低温固化后包埋块硬度及切片韧性均适中，切片不易变形、脆裂，可保证样品的完整性。低温包埋对于组织无热损伤影响，切片也易于染色。

图片分享

a图:“*”为牙龈、“▲”为牙釉质、“△”为牙本质；b图: “△”为牙本质、“△”为牙槽骨。

a图:“↘”为成骨细胞，“↗”为成骨细胞埋于类骨质中变为骨细胞，“↘”示骨细胞；b图:“↗”破骨细胞吸收破坏的骨组织。

注：组织样本来源于南华大学附属第一医院。

a图、b图:“*”为种植体，“▲”为新生软骨。

注：组织样本来源于南华大学附属第一医院。

a图: “*”为种植体，“▲”为细胞外基质，图中成纤维细胞、淋巴细胞、脂肪组织等清晰可见，种植体周围未形成骨组织；b图: “*”为种植体，“▲”为纤维包囊，“▲”为细胞外基质，图中成纤维细胞、红细胞、淋巴细胞、浆细胞等清晰可见，种植体周围未形成骨组织。

硬组织切片用于骨形成的动态观察，a图、b图“↘”为新生骨的荧光标记。

结果评价

对于骨植入评价多为两方面考虑：1.种植体促骨生长或与骨结合效果评价；2.骨组织对植入材料的生物学反应评价。 评价骨生长情况时，可用骨组织形态计量学（Bone histomorphometry）方法，通过硬组织切片计量骨组织静态和动态参数以评估骨组织生长情况。静态参数有诸如骨小梁的测量、骨组织细胞的计量、类骨质的测量等；动态参数可用荧光标记的方法测量骨矿化沉积率。 对于材料植入后骨组织学特性评价，诸如囊腔形成、炎症、多形核白细胞、巨噬细胞、浆细胞的存在，可根据标准ISO 10993-6 2016 Biological evaluation of medical devices —Part 6Tests for local effects after implantation对植入物周围组织进行炎性反应和组织学反应评估，见下图。