目前，耐药现象日益常见，已经成为全球公共卫生安全最大威胁之一。其中革兰氏阴性菌耐药现象尤为严峻。根据2020年中国细菌耐药监测网（Chinet）耐药监测，经过对90955株呼吸道标本分离菌的主要菌种分布数据的分析，发现从2017年起，肺炎克雷伯菌在呼吸道标本的分离率超过了鲍曼不动杆菌，排名上升至第1位。
现阶段，快速精准识别耐药菌已经成为克服耐药的重要环节。传统的微生物培养和药物敏感性检测存在明显的缺点，例如检测谱窄、敏感性差、耗时较长、缺乏专业培养基、延迟应答等。随着分子检测技术在细菌耐药基因检测中的应用，能够推断出细菌耐药基因的表型，高通量测序技术开始进入研究领域。2021年12月9至12日，中华医学会呼吸病学年会于厦门福建召开，会上，南京医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科的孙文逵教授为大家分享了“mNGS在广泛耐药革兰氏阴性菌耐药表型诊断中的临床应用”的专题报告，让我们一起来看看吧！病原微生物呈现的耐药特征称之为耐药表型；拥有的耐药基因称之为耐药基因型。孙文逵教授认为，病原微生物的耐药基因决定耐药表型，而耐药表型和耐药基因型之间并非完全一致的。那么，传统检测微生物耐药的方法包括稀释法、扩散法、自动化仪器法；而基因-表型检测包括聚合酶链式反应（PCR）检测、DNA芯片矩阵、高通量测序。优势：目前抗微生物药物敏感性试验（DST）依然是细菌耐药检测的主要手段，也是“金标准”，可以定量检测耐药程度。劣势：耗时较长，平均为5-7天，对检测的药物选择存在偏倚性和滞后性，不能够识别耐药机制。优势：耗时短，仅需平均耗时72小时即可获得检测结果，并且敏感性高。劣势：会出现假阳性现象，也就是基因-表型不匹配，PCR法一次只能检测一种基因，费用高，临床应用少。高通量测序又包括了全基因组测（WGS）、宏基因组测序（mNGS）、靶向基因组测序（tNGS），其中WGS和mNGS属于无靶向的高通量测序，可以对数十万到数百万条DNA分子序列进行无偏倚读取；但WGS检测的是标本培养分离后的纯菌落，进而获取全部基因信息；而mNGS则是直接检测送检标本，进而获取所需的基因信息。
测序技术又需要通过哪些耐药机制来检测细菌耐药？孙文逵教授认为，细菌对抗菌药物的耐药机制一般有3种：（1）抗菌药物到达靶位点的穿透力降低，抗菌药物的外排增加；各种机制都存在相应的基因改变，其中编码水解酶基因和细菌耐药的抗菌药物具有最直接的关系。水解酶包括β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）、碳青霉烯酶，其中碳青霉烯酶最受关注，分为A类、B类、D类。革兰氏阴性菌抗菌药物的水解酶分为ESBL、耐碳青霉烯酶、头孢菌素酶。不同的水解酶存在各自相对应的编码基因，例如ESBL常见耐药编码基因包括TEM、SHV、CTX-M、OXA等；碳青霉烯酶编码基因包括IMI、KPC、GES、IMP、VIM、NDM等；头孢菌素酶编码基因主要为AmpC和少数耐药亚型。
孙文逵教授认为，从分子检测角度分析，水解酶基因与抗菌药物之间的特异性较强，研究革兰氏阴性菌水解酶基因及其表型的相关性可能更具临床应用意义。mNGS研究主要集中于致病微生物诊断识别，耐药基因检测的研究较少。鉴于WGS与mNGS在技术上存在较高的一致性，因此推测mNGS在检测耐药基因型中可行。近年来逐渐多项研究提示mNGS在耐药基因检测具有临床应用价值。根据2014年Hasman研究，其通过WGS直接检测尿液标本病原体及其耐药基因，发现直接检测样本所获取的信息和药物敏感性试验及纯菌株WGS检测一致。在2017年，Rounak团队直接测序及培养肺囊性纤维化患者的痰液标本，发现测序不但可以提供更完整的微生物学信息，而且还可以给予相关准确耐药信息。在2020年，国外团队还发现了直接测序抗菌药物耐药基因型与某些特定抗菌药物间密切相关。 关于《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识（2021）》解读，孙文逵教授认为应当包括4方面内容：（1）mNGS结果解读，确定病原体，解读参数包括：读长、特异性读长、序列数、覆盖率、深度、丰度、阈值；（2）分析是否存在耐药风险，耐药高危因素包括：既往使用广谱头孢菌素类、碳青霉烯类药物以及机体功能状态和自身免疫功能状态；孙文逵教授提出，目前也有共识根据mNGS的检测结果指导临床抗菌药物的使用方案，可见其临床应用价值越来越重要。但是，mNGS检测耐药基因存在一定的局限性，主要表现在3个方面：（1）mNGS技术层面的核酸阅读序列比较短，一般不超过300bp，不能够获取耐药基因全长序列信息，难以准确划分不同的耐药基因亚型。（2）mNGS全覆盖无偏倚，标本类型和质量对检测结果会造成一定的影响。例如，慢性呼吸道感染患者的送检标本可能会存在大量携带耐药基因的定植菌，不能够准确判断耐药基因的来源。（3）mNGS检测细菌耐药，只能定性，而不能定量，不能调整抗生素使用的剂量。病例情况：患者，女性，50岁，因颅脑外伤20余天入院，车祸外伤撞击头面部，当地医院行颅内血肿清除术后反复发热，伤口脓液及呼吸道标本多次送检培养显示耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，使用了美罗培南+万古霉素+头孢他啶-阿维巴坦，均无效。细菌培养结果：头颅外伤皮瓣处脓液细菌培养：肺克雷伯菌；痰培养：肺克雷伯菌+鲍曼不动杆菌。治疗方案：（1）缝合+引流；（2）抗感染：使用了头孢他啶-阿维巴坦，治疗后检测分泌物发现耐药肺克雷伯菌+耐药鲍曼不动杆菌；使用了替加环素，肺泡灌洗液检测出敏感肺克雷伯菌+耐药鲍曼不动杆菌；使用了美罗培南+头孢曲松，肺泡灌洗液检测出耐药鲍曼不动杆菌。经过10天的治疗，患者的肺部感染获得明显改善，但是体温居高不下，经常体温达39℃，脑脊液常规和生化菌显示存在感染，脑脊液反复培养结果为阴性，因此进行脑脊液mNGS检测，结果检出肺炎克雷伯氏菌，耐药基因为OmpD、NDM-25，其中OmpD的耐药类型包括单环β-内酰胺类、头孢菌素、碳青霉烯类、青霉烯类、青霉烷类；NDM-25的耐药类型包括碳青霉烯类、头孢菌素类、青霉烷类。根据以上mNGS检测结果调整用药方案，加入了氨曲南2g，q6h。调整后，患者的体温恢复正常，再无高热现象。患者的脑脊液性状也好转，从黄色脑脊液转化为无色脑脊液，可见感染情况得以明显的改善。综上，基于mNGS耐药基因的抗感染药物调整需结合耐药高危因素、当地流行病学、临床病史等，mNGS检测技术在水解酶相关耐药基因和耐药表型诊断中一致，基于耐药基因驱动抗感染基因驱动抗感染药物方案的精准治疗，具有理想的应用前景。仅供医学人士参考
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