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COOK CELL  一、细胞培养概念 细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。 细胞培养可分为原代培养和传代培养；直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器（同样底面积的容器）中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。   二、细胞复苏 1、 细胞复苏遵循“慢冻快融”的原则，所以细胞冻存管从液氮中取出后，稍等待液氮挥发后，将冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动融化（约1min） 2、 吸取细胞混悬液加入离心管，800rpm离心3min，弃去上清 3、 加入对应细胞的完全培养基，重悬细胞，再以5x105个/ml细胞接种至培养瓶/培养皿中 4、 放入37℃培养箱中，CO2 5%培养，定时观察细胞培养情况  三、细胞冻存 1、 悬浮细胞：吸取细胞悬液，800rpm离心3min，弃掉上清 2、 贴壁细胞：用移液管或者巴氏吸管吸取培养液，加入PBS轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，冲洗细胞，然后吸取丢弃PBS，加入胰酶消化，轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，使胰酶与细胞表面充分接触，放到37℃孵育2-3min（对于新培养的细胞，建议消化时每隔30s镜下观察消化情况，以确定合适的消化时间），加入含血清完全培养基终止消化，用移液器吸取瓶内液体轻轻冲洗容器表面，使细胞流入容器底部，重复2-3次，将细胞悬液移到离心管中，800rpm离心3min，弃去上清 3、 加入冻存液：加入细胞冻存液（最好是用10% DMSO 完全培养基冻存细胞）重悬细胞，使细胞浓度在（5～10)×105个/ml，然后分装到冻存管中 4、 程序降温盒：4℃放30min → -80℃ 过夜（至少4-8h）→ 液氮（长期保存） 5、 温馨提醒： 4℃ 30min这个步骤一定不能省略，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损；细胞-80℃保存不要超过一个月，长期保存要放在液氮中，保持细胞活性 赛库生物的细胞每一个批次都会进行一次支原体和STR检测  四、细胞传代 1、 悬浮细胞：吸取细胞悬液，800rpm离心3min，弃掉上清，加入新鲜的含血清的完全培养基，用吸头小心重悬细胞，按细胞生长密度将细胞悬液均匀分配到培养容器中进行传代培养 2、 贴壁细胞：用移液管或者巴氏吸管吸取培养液，加入PBS轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，冲洗细胞，然后吸取丢弃PBS，加入胰酶消化，轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，使胰酶与细胞表面充分接触，放到37℃孵育2-3min，加入含血清完全培养基终止消化，用移液器吸取瓶内液体轻轻冲洗容器表面，使细胞流入容器底部，重复2-3次，将细胞悬液移到离心管中，800rpm离心3min，弃去上清，加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液，按细胞生长密度将细胞悬液均匀分配到培养容器中进行传代培养 3、 将培养容器放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞生长情况 4、 温馨提示：细胞传代需等面积按比例传代，如T25培养瓶培养，需1:2传代，应是将细胞悬液分为两份各加入T25培养瓶中进行培养  五、注意事项 1、 细胞的冻存和复苏一定要遵循“慢冻快融”的原则，最大限度的保证细胞活性 2、 培养皿/培养瓶/培养板选择：贴壁细胞培养选用TC处理的 3、 使用L-15培养基时，培养瓶要用非透气盖的培养瓶，因为L-15培养基的成分会与CO2反应 4、 细胞培养换液：一般2-3天换液，有的细胞生长速度慢，可适当延长，但是也不要超过7天换液，如果换液后培养基快速变黄，则大概率是细胞被污染 5、 培养细胞最适PH为7.2-7.4，过酸、过碱会导致细胞形态发生异常，甚至死亡 6、 细胞密度达到70%-80%汇合度，此时处于对数生长期，最适合传代 7、 当细胞出现污染时，细菌污染可视污染程度决定是否加抗生素挽救，真菌污染和支原体污染建议不要（除非细胞很珍贵，难获得），当出现污染需要加抗生素处理时，在开瓶前需要把所有东西都准备好，并将操作台上无关的用品移走，避免造成二次污染 8、 移液废液缸建议外置，内置废液缸易引入污染 9、 在超净台/生物安全柜操作时左右手不能交叉，放置实验用品时需75%乙醇消毒再放入，严格按照操作规范进行   |
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来自： 新用户80408249 > 《细胞》
