【原】磷酸化修饰多肽的设计的建议

随着长度的增加，从磷酸化的那个氨基酸往后偶联效率逐渐降低。合成方向从C端到N端，建议磷酸化的那个氨基酸以后的残基不要超过10 个，也就是说从N端往C端数磷酸化氨基酸之前的氨基酸残基最好不要超过10个。

问: 如何选择多肽N端修饰和C端修饰?

答: 肽的末端默认为N端游离的氨基，C端游离的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列，为了与母本蛋白更为接近，肽末端往往需要封闭，即N端乙酰化，C端酰胺化，这种修饰避免引入多余电荷，也使其更能防止外切酶作用，使肽更加稳定。

问: 我需要合一条环肽，其中含有一个色氨酸，它会被氧化吗?

答: 色氨酸的氧化是肽氧化中的常见现象，而肽一般是先环化再纯化，如果其中的色氨酸发生了氧化作用，肽在HPLC柱上的滞留时间会发生变化，因此被氧化的肽可以通过纯化去除。另外，氧化的肽也可以通过MS检测到。

问: 含有Cys的多肽在出货前经过还原了吗?

答: 如果没有发现肽已经被氧化，我们一般不对Cys进行还原。所有的多肽都是由粗品在pH 2条件 下纯化、冻干后得到的，这样的pH条件至少在某种程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般 在pH 2条件下进行纯化，除非有特殊原因需要在pH6.8条件下纯化。如果纯化在pH6.8进行， 纯化产物必须马上用酸处理以防氧化。在最后的质量控制环节，对于含有Cys的肽，如果MS图谱上发现有分子量为(2P+H)的物质存在，说明Cys已经氧化形成二聚体。如果MS和HPLC都没有问题，我们就直接冻干后出货。需 要指明的是，含有Cys的肽随着时间的推移会发生缓慢的氧化，氧化程度主要取决于肽序列及贮存条件。

问: 荧光标记时，肽和修饰标记的染料之间需要加一个间隔吗?

答: 多数染料属于大分子量芳香族氨基酸，为了避免多肽与荧光标签之间发生相互作用（比如，FITC很容易结合多肽序列中的半胱氨酸残基或者赖氨酸残基。），维持蛋白的构象及其生物学活性，我们推荐引入一个可弯曲的间隔区，比如Ahx, Ahx是一个含有6碳分子的环状结构，可以维持荧光标签的稳定性。

通常情况下，生物素、FITC一类的染料既可以标记在蛋白的氨基端也可以标记在蛋白的羧基端。然而，为了在最短时间内，最便捷又高效地合成多肽，固拓生物推荐客户选择标记在氨基端。因为一个多肽的合成往往是从羧基端开始的，这样一来，氨基端的修饰便成为最后一个环节，不需要再进行特别的结合作用。反之，羧基端修饰需要额外的环节，因此过程更加复杂。

问: 多肽一般有哪几种盐的形式?通过什么方式转盐或脱盐?

答: 多数多肽都是在TFA体系下分离纯化的，所以多肽以TFA盐的形式最多，其次药物肽一般有醋酸盐及盐酸盐的形式，极少数药物肽会有一些特殊的盐形式。转盐方式多为离子交换法和HPLC法，而脱盐可用G25（安马西亚出的一种葡聚糖凝胶）柱。一般醋酸盐及盐酸盐的价格比TFA的价格高出20%-30%。