抑制内皮中的糖酵解通路PFKFB3诱导肿瘤血管正常化，抑制肿瘤细胞的转移，并改善化疗疗效。

外科黄文斌 2022-11-29 发布于广东

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Inhibition of the Glycolytic Activator PFKFB3 in Endothelium Induces Tumor Vessel Normalization, Impairs Metastasis, and Improves Chemotherapy

今天要给大家分享的是发表在Cancer Cell上的一篇关于肿瘤血管内皮细胞代谢的研究性论文，论文研究发现抑制内皮中的糖酵解通路PFKFB3可以诱导肿瘤血管正常化，抑制肿瘤细胞的转移，并改善化疗疗效。

研究背景

内皮细胞(EC)的代谢逐渐成为抑制血管生成的一个新靶点。已有文献报道阻断糖酵解关键酶PFKFB3或脂肪酸氧化关键酶CPT1A可降低眼部和炎症性疾病的血管生成，但未研究PFKFB3-阻断剂3-(3pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-丙烯-1-酮(3PO)对肿瘤血管的影响。肿瘤内皮细胞（TECs）处于激活态，但尚不清楚它们是否有糖酵解代谢改变，以及靶向TECs中的葡萄糖代谢是否能提供治疗益处。与旨在抑制肿瘤血管生长的传统抗血管生成疗法相比，一种新兴的策略是使肿瘤血管正常化以恢复灌注，从而在改善化疗的同时减少转移。然而，所有血管正常化策略都侧重于靶向血管生成生长因子和下游信号的转导。而对靶向肿瘤内皮细胞葡萄糖代谢对肿瘤血管的影响目前尚不清楚，因此，本文作者对其进行了探究。

实验结果

1.TECs处于高度糖酵解的代谢状态

作者将B16-F10黑色素瘤细胞注射到野生型(WT)小鼠的门静脉（“P.V.B16[liver]”模型）中，诱导肝脏肿瘤生长。14天后，从肿瘤感染的肝脏中分离TECs，并从健康小鼠肝脏中分离正常内皮细胞（NECs）作为对照，随后进行了探索性的RNA测序。作者重点关注ECs中可检测到的1255个代谢基因。相关热图分析和层次聚类显示NECs和TECs分成不同的代谢簇，表明它们的代谢基因特征不同（图1c)。随后的路径定位和热图析显示，大多数糖酵解基因在TECs中转录上调（图1D和1E)，包括PFKFB3、葡萄糖转运蛋白GLUT1(SLC2A1)和糖酵解侧途径的限速酶，如参与生物量（核苷酸）合成的磷酸戊糖途径(PPP)（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[G6PDX]；己糖-6-磷酸脱氢酶[H6PD])和丝氨酸生物合成途径(SBP)（磷酸甘油酸脱氢酶[PHGDH])（图1D和1E)。由于数据表明TECs增加糖酵解以支持增殖和生物合成，所以作者将研究重点放在了葡萄糖代谢上。

随后作者利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）,测量了TECs中糖酵解、PPP和核苷酸合成代谢产物的稳态水平。结果表明在TECs中，这些途径的一些代谢产物的水平升高（图1H）。同时体外实验表明，葡萄糖消耗和乳酸排泄增加（图1I和1J)。

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2.抑制PFKFB3减少肿瘤的侵袭和转移

代谢途径分析进一步显示，糖酵解通量在TECs中几乎高出3倍（图2a)，而与ATP产生相关的葡萄糖氧化和氧消耗没有改变（图2b和2c)。同时，TECs在RNA和DNA中流入了更多的¹⁴C（图2D)，这意味着TECs利用更多的葡萄糖碳来进行生物合成。同时，低氧增加了NECs和TECs中的糖酵解（图2E和2F）。

为了阐明PFKFB3在肿瘤血管生成中的作用，作者使用遗传学和药理学的方法来抑制PFKFB3。在遗传学方面，作者获得ECS中PFKFB3单倍缺陷的PFKFB3 /Dec小鼠。然后在PFKFB3 /Dec小鼠皮下（S.C.）植入B16-F10黑色素瘤（“S.C.B16”模型）或Lewis肺癌(LLC)细胞（“S.C.LLC”模型）。PFKFB3 /dec小鼠的NECs和ETECs的糖酵解较低，但缺氧增加了两种基因型的糖酵解（图2E和2F）。为了评估3PO治疗对PFKFB3的药理阻断作用，作者使用了两种肿瘤模型，即胰腺PANC02原位植入和S.C. B16模型。结果显示PFKFB3 /DEC小鼠和WT相比，B16-F10的肿瘤体积、终末期肿瘤重量、癌细胞增殖和凋亡无显著性差异。但是在PFKFB3 /Dec小鼠中，肿瘤坏死、转移和侵袭减少，肿瘤边界更加清晰（图2I-2K）。CD31和Endoglin双重染色，同时标记ECs和B16-F10细胞，显示在PFKFB3 /DEC小鼠中，腔内含有癌细胞的肿瘤血管的比例和血管内癌细胞的数量减少，表明癌细胞的侵入受损（图2L-2N)，循环癌细胞的集落形成证实了这一点（图2O)。随后作者还探讨了PFKFB3抑制是否影响晚期转移。在尾静脉注射B16-F10细胞后，PFKFB3 /DEC小鼠肺转移减少（图2P)。

为了模拟PFKFB3单倍性缺陷，使用了低剂量的3PO（25毫克/千克；每周三次），这减少了体内的糖酵解（图3a)。该剂量不影响肿瘤的生长和癌细胞增殖（图3b)。同时，培养的NECs和TECs对PFKFB3的阻断比癌细胞更敏感（图3D-3G)。3PO治疗在B16-F10和PANC02肿瘤模型中均表现出与敲除鼠类似的结果（图3H-3N）。

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3.PFKFB3抑制改善灌注

通过CD31染色探讨PFKFB3单倍缺陷是否改变了肿瘤血管的结构和功能特性。与WT小鼠相比，PFKFB3 /Dec小鼠的B16-F10肿瘤具有相当的血管密度（图4A和4B)；然而，血管腔大小和总可灌注面积（所有血管腔面积之和）增加（图4C和4D)。同时肿瘤血管中EC增殖（图4E)以及凋亡减少了（图4F)，从而平衡了异常的EC生长。同时，染色显示PFKFB3 /dec小鼠肿瘤中的血管结构更加规则（图4g、4h和4i)。由于这种形态发生重排，PFKFB3 /dec小鼠的肿瘤血管每微米横截面血管长度含有较少的EC核（图4J)。

由于缺氧促进癌细胞侵袭和转移，作者又研究了肿瘤的灌注和氧合。注射异硫氰酸荧光素结合凝集素（标记灌注血管）和CD31染色识别所有肿瘤血管，显示PFKFB3 /dec小鼠灌注肿瘤血管面积增加（图4K和4L)。缺氧标记物染色显示PFKFB3 /dec小鼠缺氧B16-F10肿瘤面积减少（图4M和4N)。同样，在给予抑制剂的黑色素瘤模型上得到类似的结果（图5A-5L)。

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B16-F10肿瘤切片的CD31和Ve-cadherin染色显示，PFKFB3 /dec小鼠的Ve-cadherin 粘附连接更丰富，染色更强（图6a)。此外，扫描电镜显示，在PFKFB3 /DEC小鼠的肿瘤血管中，有规则、光滑、有序、平坦的单层ECS表面，而在WT小鼠中，则有更不规则、无序组织和经常不连续的ECS内衬（图6b)。

作者又进一步评估了PFKFB3抑制对培养的NECs和人脐静脉ECs（HUVECs,简称ECs）中VE-cadherin 粘附连接(AJS)的调节作用。PFKFB3阻断增加了连续的Ve-cadherin AJS的长度，而减少了不连续的Ve-cadherin AJS的比例，从而表明3PO促进了血管的完整性和EC之间的连接（图6c和6d)。PFKFB3阻断还减少了细胞间隙的数量，进一步证明了单层更紧密，更紧密，更完整（图6E)。然后作者探讨了PFKFB3阻断是如何增加质膜VE-cadherin水平的。作者使用Phrodo-Dextran，其强度随着酸度的增加而增强（如在酸化的内吞囊泡中），结果观察到PFKFB3阻断减少了Phrodo-Dextran在ECS中的内化（图6g和6h)。类似地，用荧光标记的抗VE-cadherin抗体孵育ECs，然后用温和的酸洗去除细胞表面结合的抗体，发现在VEGF刺激NECs时，细胞内有荧光标记的积累（图6I和6J)。值得注意的是，3PO单独没有影响，但在很大程度上消除了由VEGF诱导的NECs中VE-cadherin内吞的增加（图6I和6J)。同时，PFKFB3阻断减少了被白细胞介素-1β(IL-1b)或肿瘤坏死因子α(TNF-a)预先激活的癌细胞粘附和迁移到ECS的数量（图7a-7c)。值得注意的是，粘连减少是由于EC促炎特征的改变。在IL-1b激活时，PFKFB3抑制的ECS表达较低水平的VCAM-1、ICAM-1和E-选择素（图7D)，在PFKFb3 /dec小鼠的肿瘤中，TECs中的ICAM-1免疫反应水平较低（图7E)。最后，作者从NF-kB信号传导对其进行了机制的阐述。结果表明PFKFB3的抑制减少了NF-KB信号传递（图7f-7j)。

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4.PFKFB3抑制促进血管成熟

在健康微血管中，静止的周细胞保持不动并覆盖ECS，但在肿瘤血管中，周细胞被激活并更活跃地增殖，但与肿瘤ECS分离（导致周细胞覆盖减少），部分原因是粘附特性降低（由于神经(N)钙粘蛋白水平降低，介导ECS与周细胞之间的粘附）和运动性增加。此外，不稳定的肿瘤血管不断重构，使其基底膜（部分由静止周细胞沉积）不完整甚至缺失。CD31和周细胞标记NG-2双重染色显示，在PFKFB3 /dec小鼠的B16-F10肿瘤中，周细胞复盖ECS较多（图7K和7L)。WT小鼠的大部分肿瘤血管由无层粘连蛋白阳性基底膜或仅有层粘连蛋白阳性基底膜的裸ECs组成，而PFKFB3 /Dec小鼠的肿瘤中含有更成熟的CD31 层粘连蛋白血管（图7m)。在分析 B16-F10或PANC02肿瘤经3PO处理（图7N、7O)时，获得了类似的改善血管成熟的结果。鉴于3PO处理改善周细胞复盖率超过EC缺乏的PFKFB3（图7O与图7L)。

5.PFKFB3阻断促进化疗的递送和疗效

最后，作者探讨了用3PO治疗B16-F10荷瘤小鼠是否增强了顺铂(CPT)的抗肿瘤效应(2.5mg/kg体重；每周3次），（图8i)。当小鼠在给予CPT之前用3PO预处理以诱导TVN，然后继续用3PO处理时，CPT更明显地抑制了肿瘤的生长（图8i)。值得注意的是，CPT单药治疗并没有显著降低对照组小鼠的转移负担，但联合3PO几乎完全阻止了转移（图8J)。化疗效果的改善伴随着更有效的CPT递送。事实上，当在给予单剂量CPT（10毫克/千克）之前用3PO治疗B16-F10荷瘤小鼠时，我们观察到与对照组相比，用3PO治疗的癌细胞中有更多的CPT-DNA加合物（图8L)，表明CPT的递送增加。3PO和CPT联合应用的体内抗肿瘤作用的增强并不是因为在3PO存在的情况下癌细胞对CPT的化疗敏感性增加（图8m)。