Hi

一、技术原理

基因组研究的维度可以分为很多种，例如下图所示

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其中Hi-C是研究三维结构的一种方法。Hi-C技术源于染色体构象捕获（Chromosome Conformation Capture, 3C）技术，利用高通量测序技术，结合生物信息分析方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系，获得高分辨率的染色质三维结构信息。

其中染色质构象捕获（3C）技术是用福尔马林瞬时固定细胞核染色质，用过量的限制性内切酶酶切消化染色质 - 蛋白质交联物，在 DNA 浓度极低而连接酶浓度极高的条件下用连接酶连接消化物，蛋白酶消化交联物以释放出结合的蛋白质，用推测可能有互作的目的片段引物进行普通PCR和定量PCR来确定是否存在相互作用。3C 技术假定物理上互作的 DNA 片段连接频率最高，以基因座特异性 PCR 来检测基因组中 DNA 片段之间的物理接触，最终以 PCR 产物的丰度来确定是否存在相互作用。

从原理来讲，你可以大致理解为：染色质被包裹在一种3D结构中，序列在同一染色体上相距越近，在空间上也就越靠近，所以如何确认哪些contigs在空间上更接近，那么就可以变相认为这些contigs在一条染色体内。

二、技术流程

1、甲醛固定

利用甲醛将样品固定，将细胞内蛋白与DNA、DNA与DNA之间进行交联，保存其相互作用关系，维持细胞内的3D结构。一般将活体样本在室温用 1-3%的甲醛处理 10-30min，但是此步骤会减少限制内切酶对DNA序列的消化效率，需要严格控制。

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2、酶切序列

利用限制性内切酶将DNA进行酶切，使交联两侧产生粘性末端。

打断后的片段大小会影响测序分辨率，一般有两种酶可供选择：6bp 的限制性内切酶，4bp 的限制性内切酶。后者具有更高的分辨率。EcoR1 或 HindIII 用于每4000bp切割一次基因组，在人类基因组中产生约100万个片段。

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3、末端修复

得到的片段具有平末端或粘性末端，然后将末端补平修复。利用末端修复机制，引入生物素标记的碱基，便于后续DNA纯化和捕获。

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4、环化

使用 T4 DNA连接酶将末端修复后的 DNA 进行环化，将含有互作的 DNA 片段之间进行环化。将连接DNA片段的蛋白质消化掉，得到交联片段。

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5、DNA纯化和捕获

将 DNA 解交联，纯化DNA,破碎为300 bp - 700 bp的片段，利用链亲和素磁珠捕获含有互作关系的DNA片段进行文库构建；

使用超声波或其他方式，再次打断片段。

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6、上机测序

用磁珠将带生物素的捕获，制作文库，上机测序。

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三、分析步骤

Hi-C的优势在于其结合了二代测序，这势必也使得其数据分析相对复杂了。目前比较成熟的数据分析流程大致包含6个步骤：

（1） 前期raw reads过滤（跟一般二代测序数据处理基本一致）
（2） 序列比对。建议采用pair-end测序模式
（3） 定位酶切位点。比对寻找到reads pairs在基因组物理位置之后，通过插入片段大小的限制搜索reads pairs两端每条read所对应的最近的酶切片段。酶切片段的位置代表了DNA交互产生的大致位置。
（4） 筛选出有效的比对片段。配对的reads位于酶切位点两端且mapped的方向相反。
（5） 整合DNA 片段交互强度。
（6） DNA片段交互矩阵标准化。

分析流程可如下图所示：

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valid pairs的区分

Valid Pairs：双端Reads分别来源于空间上相邻但线性上不相邻的两个酶切后的DNA片段，其能够提供有效的交互信息。

需要经过数据筛选，获取符合要求的valid pairs，用于后续比对和位置信号分析，最终才能用于contigs的染色体聚类。

筛选过程的示意图如下：

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（1）Unique valid pairs
双端序列可以通过二代比对到基因组，结合基因组上酶切位点信息，通过一对read pairs双端的距离和方向的情况以及是否是unique比对，排除重复干扰，寻找到有效的pairs，高频率比对区域，如果reads一模一样，而且频数远远高于其他比对，就需要PCR去冗余，降低因为PCR引起的高频信号干扰。

（2）Invalid pairs
这种情况，你可以认为是环化reads打断后，两端的reads不能提供有效信息，具体可能是超声波打断的随机性，环化拼接的随机性等等，所以需要筛掉，因为这些信息只能提供错误的信号，导致无法合理分染色体，分方向。往往如果hic热图不合理，建议查看有效数据量是否达标以及可以尝试用该数据去挂载同源已发表的物种，以此判断是数据问题还是组装问题。

四、Hi-C组装

一般利用LACHESIS(Burton, J.N., et al. 2013)等软件根据得到的valid pairs信号支持，对基因组序列进行群组的划分、排序和定向，然后进行人工调图和检查，最终获得版本染色体水平基因组。

软件算法原理如下：

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根据得到的有效pairs,一对pairs一般就能提供图中的一组信号，而根据空间距离和序列距离成大致的正比关系，可以知道距离越近的contigs间，支持的pairs越多，信号越强。所以通过信号的强弱，可以区分contigs的内部情况，进行纠错：一般是打断错误拼接的contigs，调整contigs的方向，也可以区分contigs是否在一条染色体，进行聚类。最终得到一个较为合理的染色体版本基因组，而细节处无法被软件合理调整的地方，最终需要人工进行微调，形成一条对角线信号。

五、Hi-C测序技术的优势：

1. 通过Scaffold间的交互频率大小，可以对已组装的基因组序列进行纠错（基因组更准确）。
2. 基因信息不再仅仅是contig片段，而是被划分至染色体上，成为染色体水平。
3. 无需辛苦的构建群体，单一一个体就能实现染色体定位。
4. 相比遗传图谱，标记密度更大，序列定位更完整（能把更多的contig挂至染色体上!信息更全面！）
5. 染色体重排等结构变异研究可以开展啦~(研究可以更深入！）
6. QTL、GWAS可以定位区间到某个染色体啦~（追踪变异！）
7. 该物种的三维基因结构、染色体互作及动态变化可以解析啦~（从基因到表观！全方位解析）

参考：
https://www.jianshu.com/p/94cd5a8e829e
https://mp.weixin.qq.com/s/U_pQnyCgrtFGua144jHdvA