Anopheline mosquitoes are protected against parasite infection by tryptophan catabolism in gut microbiota 作者：Yuebiao Feng, Yeqing Peng, Xiumei Song, Han Wen, Yanpeng An, Huiru Tang, Jingwen Wang Nature Microbiology：2022/04/18 摘要：The mosquito microbiota can influence host physiology and vector competence, but a detailed understanding of these processes is lacking. Here we found that the gut microbiota of Anopheles stephensi, a competent malaria vector, is involved in tryptophan metabolism and is responsible for the catabolism of the peritrophic matrix impairing tryptophan metabolites. Antibiotic elimination of the microbiota led to the accumulation of tryptophan and its metabolites—kynurenine, 3-hydroxykynurenine (3-HK) and xanthurenic acid. Of these metabolites, 3-HK impaired the structure of the peritrophic matrix and promoted Plasmodium berghei infection. Among the major gut microbiota members in A. stephensi, Pseudomonas alcaligenes catabolized 3-HK as revealed by whole-genome sequencing and LC–MS metabolic analysis. The genome of P. alcaligenes encodes kynureninase (KynU) that is responsible for the conversion of 3-HK to 3-hydroxyanthranilic acid. Mutation of KynU resulted in a P. alcaligenes strain that was unable to metabolize 3-HK and unable to protect the peritrophic matrix. Colonization of A. stephensi with KynU-mutated P. alcaligenes failed to protect mosquitoes against parasite infection as compared with mosquitoes colonized with wild-type P. alcaligenes. In summary, this study identifies an unexpected function of mosquito gut microbiota in controlling mosquito tryptophan metabolism, with important implications for vector competence. 蚊子的微生物菌群可以影响其宿主的生理和携带能力，但有关于这些过程详情尚不清楚。本研究中，我们发现斯氏按蚊（一种疟疾媒介）的肠道菌群参与了色氨酸的代谢，并负责分解代谢掉那些有害于色氨酸代谢物的周营养基质。抗生素消除微生物群将导致色氨酸及其代谢产物--犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸（3-HK）和黄嘌呤酸的积累。在这些代谢产物中，3-HK损害了围食膜基质的结构，促进了柏氏疟原虫（Plasmodium berghei）的感染。在斯氏按蚊的主要肠道菌群中，通过全基因组测序和LC-MS代谢分析显示，产碱假单胞菌能够分解代谢3-HK。产碱假单胞菌中负责编码犬尿氨酸酶（KynU）的基因，负责将3-HK转化为3-羟基邻氨基苯甲酸。KynU的突变导致产碱假单胞菌不能代谢3-HK，不能保护围食基质。与野生型斯氏按蚊定殖产碱假单胞菌的蚊子相比，产碱假单胞菌定殖于KynU突变的斯氏按蚊后并不能保护蚊子免受寄生虫感染。综上所述，本研究确定了蚊子肠道菌群在调控蚊子色氨酸代谢中的一个意想不到的功能，对媒介能力具有重要意义。
原名：Anopheline mosquitoes are protected against parasite infection by tryptophan catabolism in gut microbiota 译名：按蚊通过肠道菌群中色氨酸的分解代谢来抵抗寄生虫感染 期刊：Nature Microbiology IF：30.964 2022.4.18：唐惠儒，王敬文 通讯作者单位：复旦大学生命科学学院
1 微生物色氨酸分解代谢影响疟原虫（Plasmodium）的感染为了确定微生物群是否参与蚊子的色氨酸代谢，我们通过液相色谱串联质谱法（LC-MS）进行了靶向代谢组学分析。我们在0 h（即吸血前）和吸血后（24 h），对正常对照组的斯氏按蚊和抗生素处理（Abx）的斯氏按蚊的色氨酸及其代谢产物进行分析。通过分析，我们共检测到13种Trp代谢物（图1a和补充表1）。基于LC-MS分析，我们发现，Abx蚊子的色氨酸含量以及犬尿氨酸通路（KP）的代谢物含量（犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸[3-HK]和黄尿酸[XA]）在吸血前显著高于对照组组蚊子（图1b）。吸血后（24 h），Abx蚊子体内的5-羟色胺（5-HT）和细菌来源的代谢产物3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）减少，而吲哚-3-乙醛（IAld）显著增加（扩展数据图1）。这些结果表明微生物群调节了斯氏按蚊体内的色氨酸代谢。缺乏微生物菌群的蚊子更易感染疟原虫（扩展数据图2a）。由于犬尿氨酸通路相关化合物Trp、Kyn、3-HK、XA和3-HAA的水平受微生物群的影响，我们假设这些代谢产物影响了蚊子对柏氏鼠疟原虫感染的易感性。我们将这5种代谢产物经口给予斯氏按蚊，随后用感染了疟原虫的小鼠饲喂斯氏按蚊。在感染8天后检查卵囊数量（图1c）。我们采用了文献9中所表述的色氨酸含量，除此之外，基于对正常蚊子进行的LC-MS分析结果，我们对包括Kyn、3-HK、XA、3-HAA以及朱砂精酸（cinnabarinic acid，CA）在内的几种代谢物采用了相对应的含量水平（附表2和3）。通过糖粉经口服补充色氨酸和3-HK均显著增加斯氏按蚊卵囊数量（图1d，f）。然而，给予Kyn、XA和3-HAA并不影响伯氏疟原虫感染（图1e、g、h）。我们还检测了3-HAA下游产物CA对伯氏疟原虫感染的影响。通过研究发现，补充CA与否的蚊子的卵囊数量相似（图1i）。为了证实3-HK能够影响伯氏疟原虫的感染，我们通过显微注射3-羟基犬尿氨酸转氨酶（HKT）特异性双链RNA（dsHKT）的方式敲除掉催化3-HK转化为XA的HKT基因，并对蚊子的感染率进行测定。同时，以靶向绿色荧光蛋白（dsGFP）的双链RNA处理的蚊虫作为对照。与dsGFP对照组相比，dsHKT处理2天后，蚊子体内的HKT水平降低了约49%，与此同时，我们观察到dsHKT蚊子体内3-HK的显著蓄积（扩展数据图3a,b）。与我们设想的相一致，与dsGFP对照相比，基因敲除HKT（dsHKT）显著增加了蚊子的卵囊数量（图1j）。为了探究3-HK究竟影响了哪一阶段的发育，我们对3-HK处理后的蚊子的外鞭毛和动合子水平进行了测定。在吸血前，经口补充3-HK显著增加了3-HK水平，但不影响蚊子的存活（扩展数据图4a、b）。但与对照组相比，给予3-HK虽然不影响疟原虫的外鞭毛率，显著增加了卵动蛋白的数量（图1k和扩展数据图4c）。动合子必须穿过围食基质和中肠上皮才能发育成卵囊。动合子和卵囊数量的增加表明3-HK促进了寄生虫的中肠穿越过程。此外，我们发现，3-HK处理后的蚊子的孢子数量显著高于对照组（图1l），这表明3-HK处理增加了在小鼠中的传播。这些结果表明，色氨酸代谢，尤其是犬尿氨酸途径受蚊子及其微生物菌群共同调控。3-HK的积累能够促进寄生虫的感染。
图1 微生物通过调节Trp代谢进而调节伯氏疟原虫的感染。a代表本研究中与色氨酸代谢相关的标准品；本研究中检出的代谢物以粗体显示。5-HTP、IAM和IAA分别代表5-羟基-色氨酸、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙酸。其他缩略语均在文中进行了定义。b代表基于LC-MS分析了抗生素处理的蚊子（Abx，n = 9）与正常蚊子（N，n = 10）在吸血前（0h）的Trp、Kyn、3-HK、3-HAA、XA、5-HTP以及5-HT的倍数变化。所有数据均以平均值±标准差形式表示。c代表斯氏按蚊色氨酸代谢物处理的工作流程。d-i分别表示伯氏疟原虫感染对Trp代谢产物：Trp（d）、Kyn（e）、3-HK（f）、XA（g）、3-HAA（h）以及CA（i）的影响。j代表疟原虫经HKT敲除后对败血性蚊子感染的影响。k-l分别代表对照组和3-HK处理组蚊子的动合子（k）和孢子（l）数量。排除批次效应引起的潜在偏倚后，合并至少两项独立实验的数据。d-l中的水平黑线表示数据中位值。感染率如饼图所示。b中数据采用双侧Student t检验和d-l中数据采用双侧Mann-Whitney检验确定显著性；其中NS代表不具有显著性差异。2 3-HK介导的周围基质（PM）损伤促进了疟原虫的感染蚊子3-HK在生理条件下是促氧化剂。由于其在蚊子中较高的水平（补充表2）及其增加动合子和卵囊数量的能力，我们假设3-HK的升高可能扰乱中肠的氧化还原稳态，损害中肠上皮屏障功能并促进寄生虫感染。我们首先通过二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）染色方法，在补充3-HK与否的斯氏按蚊的体内检测了吸血前（0 h）和吸血后（24 h）中肠中的活性氧（ROS）水平。与我们的假设相反，无论是在吸血前后，3-HK处理的蚊子和对照组蚊子之间就ROS水平而言未表现出显著性差异（扩展数据图5a）。随后，我们通过对凋亡细胞和有丝分裂肠干细胞进行染色进一步探究了3-HK的摄入是否会对中肠上皮细胞造成损伤。同样，与对照组相比，3-HK处理未引起中肠上皮的显著变化（扩展数据图5b–e）。为进一步探究3-HK促进柏氏鼠疟原虫（P. berghei）感染的机制，我们在蚊子吸食受感染的血后（24 h）对补充3-HK与否的蚊子的中肠进行RNA测序（RNA-seq）。通过测序，我们在3-HK处理的蚊子中有172个基因差异表达（DEGs），其中包括47个上调基因以及125个下调基因（补充表4）。在倍数变化 > 2的下调基因中，两个基因与中肠上皮屏障功能相关，分别是mucin和peritrophin1（Per1）（图2a）。Peritrophin和mucin是周围基质（PM）的重要组成部分，可保护中肠免受病原体入侵、磨损和有毒化合物的影响。为了检测3-HK是否会对PM造成损害，我们在蚊子吸血前对蚊子口服喂食3-HK，随后分析蚊子摄入血液后Per1的蛋白水平和PM的结构。与RNA-seq结果一致，补充3-HK显著降低了中肠的Per1蛋白水平（图2b，c），并损害了PM结构（图2d）。此外，3-HK处理抑制了蚊子体内Per1的表达（扩展数据图6a）。然而，3-HK与血餐同时补充并不影响Per1的表达（扩展数据图6b）。这些结果表明，血餐前口服3-HK在损害Per1表达中起关键作用。为了证实3-HK介导的寄生虫感染性的增加是依赖于PM的完整性，基于已发表的研究，我们首先通过清除肠道菌群从而破坏PM的形成（扩展数据图2b）。与非3-HK处理的对照组蚊子相比，经口服给予3-HK导致PM受损的蚊子（Abx）的卵囊数量并未有所增加（图2e）。敲除Abx蚊子中的HKT对感染的结果也无影响（图2f）。随后，我们用多抗菌素D（一种按蚊中PM形成的抑制剂）对蚊子进行饲喂。通过饲喂我们发现，多毒素D处理完全消除了PM的形成（扩展数据图7）。此外，与仅采用多抗菌素D饲喂的蚊子相比，3-HK补充并没有加剧柏氏疟原虫造成的感染（图2g）。我们对补充Trp的蚊子进行了相同的分析。通过分析我们同样发现，与对照组相比，经口给药Trp降低了Per1蛋白的水平（扩展数据图8a）。当缺乏PM时，补充Trp不影响柏氏疟原虫感染（扩展数据图8b）。这些数据表明，3-HK的升高能够损害PM的完整性，进而促进柏氏疟原虫感染。
图2 3-HK通过损害PM促进疟原虫的感染。a以Volcano图形式显示了感染后（24 h）喂食3-HK与否的蚊子的中肠中的差异表达基因，其中橙色代表上调基因，绿色代表下调基因；b代表正常血餐后（24 h），3-HK处理（+）和对照（-）蚊子中肠Per1的Western blot图谱；c代表正常血餐后，3-HK处理（+）和对照（-）蚊子中肠中Per1的免疫染色（绿色），图中蓝色代表DAPI染细胞核，红色箭头代表Per1，图中比例尺为100 μm；d代表正常血餐后，3-HK处理（+）和对照（-）蚊虫的PM结构的PAS染色，红色箭头表示PM结构，图中比例尺为100 μm；e表示添加3-HK的Abx蚊子（+）和Abx蚊子（-）的卵囊数；f表示dsHKT和dsGFP处理的Abx蚊子的卵囊数量；g表示正常蚊子，用多毒素D处理（PD）的蚊子以及补充3-HK的PD处理的蚊子的卵囊数。e-g表示合并两项独立实验的结果，其中每个点代表一只蚊子，黑色水平线表示中位值。3 产碱假单胞菌（P. alcaligenes）参与了3-HK代谢鉴于肠道菌群可以阻止PM损害导致的3-HK积累，随后，我们确定了在3-HK分解代谢中重要的肠道共生细菌。在血餐前分析实验室饲养的斯氏按蚊肠道菌群结构。其中肠杆菌属（Enterobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄糖酸菌属（Gluconobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、弧菌属（Vibrio）、塔特姆菌属（Tatumella）、发光杆菌属（Photobacterium）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomaoans）是主要优势细菌属（图3a）。我们在京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database ）对具有代表性的物种的基因组序列进行分析，以评价它们分解代谢3-HK的能力。假单胞菌和罗尔斯通氏菌均含有犬尿氨酸甲酰胺酶（KynB，负责催化N-甲酰犬尿氨酸（FK）生成Kyn）和犬尿氨酸酶（KynU，将Kyn和3-HK水解为邻氨基苯甲酸和3-HAA）（图3a）。鉴于假单胞菌的丰度在所有所有细菌属中位居第二，随后我们研究了假单胞菌在3-HK代谢中的作用。本研究中，我们通过分离鉴定发现我们饲养的斯氏按蚊种群中的假单胞菌属为产碱假单胞菌（P. alcaligenes）（扩展数据图9a），其在血餐作用下可以迅速增殖（扩展数据图9b）。为了检测共生产碱假单胞菌对Trp分解代谢的遗传能力，基于Illumina测序我们对该菌的全基因组序列进行了鉴定。其中共有7个基因与Trp分解代谢有关。包括犬尿氨酸甲酰胺酶（由KynB编码）、犬尿氨酸酶（由KynU编码）和过氧化物酶（由Kat编码）在内的三种酶可以通过犬尿氨酸途径与Trp分解代谢相关（图3b）。色氨酸2-单加氧酶（由TMO编码）、酰胺酶和乙醛脱氢酶（由ADh编码）与吲哚途径相关，单胺氧化酶（由MAO编码）负责将5-HT转化为5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）（图3b）。为了验证产碱假单胞菌在蚊子体内分解代谢3-HK的能力，基于LC-MS技术，我们比较了Abx和产碱假单胞菌定殖的Abx蚊子之间的Trp代谢差异。在定殖2天后，产碱假单胞菌的细菌属可达1.2 * 104 c.f.u./中肠（扩展数据图9c）。与设想的相一致，与Abx蚊子相比，产碱假单胞菌定殖的Abx蚊子中产碱假单胞菌的定植促进了PM的形成，并显著降低了Trp、3-HK和XA的水平（图3c和扩展数据图9d）。然而，我们在体内未检测到3-HK的终产物朱砂酸（CA），这可能是由于其浓度较低所导致。这些结果表明，共生细菌--产碱假单胞菌，在斯氏按蚊中能够代谢3-HK。为了证实3-HK的降解具有菌种特异性，我们随后用丰度最高的共生菌--缺乏KynU的霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）定殖Abx蚊子，并分析了霍氏肠杆菌定殖的蚊子体内的色氨酸代谢。与产碱假单胞菌定殖的蚊子不同，与Abx水平相比，E. hormaechei定殖显著增加了与包括Trp、3-HK、XA和3-HAA在内的犬尿氨酸途径相关的代谢物水平（图3 d）。尽管缺乏降解3-HK的能力，但已有的研究表明E. hormaechei可刺激PM的形成。因此，PM的完整性受多种细菌相关的因素影响。产碱假单胞菌降解3-HK的能力可能是共生细菌保护PM完整性的策略之一。
图3 共生产碱假单胞菌分解代谢蚊子3-HK。a代表斯氏按蚊中参与犬尿氨酸途径的主要共生细菌，其中左侧代表16S rRNA测序检测到的实验室饲养的蚊子中主要细菌属的相对丰度（n=6），右侧代表每个属的代表性细菌物种中犬尿氨酸代谢途径的基因簇；b代表Trp通过蚊子（蓝色）和产碱假单胞菌（橙色）途径分解代谢的概述，其中HKT、KMO、KFM/KynB、TDO、TpH、AAAD、MAO、KynU、Cat、Kat、TMO以及ADh分别代表3-羟基犬尿氨酸、犬尿氨酸3-单加氧酶、犬尿氨酸甲酰胺酶、色氨酸2,3-双加氧酶、色氨酸羟化酶、芳香族氨基酸脱羧酶、单胺氧化酶、犬尿氨酸酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、色氨酸2-单加氧酶和乙醛脱氢酶；c代表血餐前产碱假单胞菌再定植（P.a.）和抗生素处理蚊子（Abx）中Trp代谢物的相对量（n = 9）；d代表血餐前霍氏肠杆菌（E.h.）再定植和抗生素处理的蚊子（Abx）中Trp代谢产物的相对量（n = 10）；c和d中的所有数据均以平均值±标准差形式表示（c,d），并通过双侧Student t检验确定显著性。犬尿氨酸酶（KynU）被注释为负责产碱假单胞菌中3-HK的分解代谢（图3b）。为了验证KynU在3-HK降解中的作用，我们构建了一个KynU突变体--P.a.ΔKynU，该突变体缺少了编码KynU的1005 bp的碱基序列（扩展数据图10a），但不会影响细菌的生长（图4a和扩展数据图10b）。我们评估了KynU对斯氏按蚊色氨酸代谢的影响。我们在Abx蚊子、野生型产碱假单胞菌定殖的Abx蚊子（P.a.WT）以及KynU突变体（P.a.ΔKynU）中检测了与犬尿氨酸途径相关的代谢产物。KynU突变导致产碱假单胞菌丧失了分解代谢3-HK的能力，其表现为P.a.ΔKynU定殖的蚊子体内的Trp、Kyn和3-HK水平显著高于P.a.WT蚊子（图4b）。KynU突变并不影响XA水平。与P.a.WT定植的蚊子相比，P.a.ΔKynU定植蚊子中的3-HAA水平也有所积累（图4b）。由于Trp由蚊子及其微生物群共同代谢，阻断产碱假单胞菌中的KynU的活性可能通过蚊子犬尿氨酸途径促进Trp的分解代谢。我们接下来采用western blot方法，以Per1作为指标，检测了细菌KynU突变对蚊子PM形成的影响。与P.a.WT相比，P.a.ΔKynU的定植并没有诱导Per1蛋白的表达（图4c）。当KynU发生突变时，产碱假单胞菌对柏氏疟原虫的抑制作用显著降低（图4d）。然而，与微生物清除一组（Abx）相比，这些突变细菌的定植仍然增加了蚊子对寄生虫感染的抵抗力。这可能是由于P.a.ΔKynU在蚊子免疫系统中的刺激。我们比较了P.a.WT和P.a.ΔKynU定植感染24h后蚊子体内的包括thioester containing protein 1（TEP1）, cecropin（CecA）, attacin （ATT）以及defensin （DEF）在内的4个免疫相关基因的表达水平。P.a.WT和P.a.ΔKynU定植的蚊子之间所有四种免疫基因的表达水平相当（图4e）。这表明，除刺激蚊虫免疫反应外，产碱假单胞菌通过参与Trp分解代谢抑制疟原虫感染，防止PM损伤造成的3-HK积累。
图4 产碱假单胞菌Kynu在蚊子体内降解3-HK。a代表感染血餐前后，Abx蚊子以及定殖P.a.WT和P.a.ΔKynU的Abx蚊子的中肠的细菌负荷（n = 6），数据以平均值±标准差形式表示；b代表感染血餐前，Abx蚊子以及定殖P.a.WT和P.a.ΔKynU的Abx蚊子中Trp代谢物的相对含量，数据以平均值±标准差形式表示；c代表正常血餐24 h后，Abx蚊子以及定殖P.a.WT和P.a.ΔKynU的Abx蚊子的中肠中Per1的免疫印迹，图像代表三个独立实验；d代表Abx蚊子以及定殖P.a.WT和P.a.ΔKynU的Abx蚊子的卵囊数量，黑色水平线表示中位值；e代表Abx蚊子（n=6）以及定殖P.a.WT（n=8）和P.a.ΔKynU（n=7）的Abx蚊子中免疫相关基因的相对表达水平，将定殖P.a.WT和P.a.ΔKynU蚊子中免疫基因的相对表达水平归一化为Abx中的基因表达，数据以平均值±标准差形式表示。通过方差分析确定显著性，b图中采用Tukey检验、d中采用Dunn检验，e中采用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段递增程序。综上所述，我们确定了一个前所未知的作用：肠道菌群通过参与蚊子色氨酸代谢促进抗寄生虫响应。色氨酸代谢在蚊子生理过程中起着重要作用，我们发现3-HK和XA是斯氏按蚊色氨酸代谢的前两个丰富的中间产物。3-HK由于其促氧化剂活性而具有毒性。它也是蚊子中主要眼色素--ommochromes的合成前体，在蛹和成年早期的蚊子的眼色素沉着中起着至关重要的作用。XA是3-HK的化学稳定产物，作为抗氧化剂保护蚊子中肠免受氧化应激损伤。它也是疟原虫外鞭毛激发子，能够增加疟原虫在蚊子中的感染性。3-HK和XA在蚊子中的具体作用取决于它们在体内的动态变化和蚊子的生理状况。除通过犬尿氨酸途径代谢外，一小部分Trp用于a的5-HT合成。5-HT是蚊子体内一种已被充分描述的神经激素，可调节蚊子的生长、繁殖和代谢。色氨酸代谢产物的多种功能使得色氨酸代谢在蚊子生理中不可或缺。微生物菌群在决定按蚊传播疟原虫的能力方面起着重要作用。通过抗生素去除肠道菌群的蚊子，其表现出免疫活性的降低以及对寄生虫感染的易感性增加。包括Asaia sp.和沙雷氏菌在内的多种寄居细菌的再定植，能够刺激免疫效应器的表达，从而抑制疟原虫的感染。除了增强蚊子的基础免疫反应外，肠道菌群还直接通过分泌抗疟原虫蛋白来抑制疟原虫。肠道菌群的稳态在保护PM结构的完整性从而保护蚊子免受按蚊病原体入侵方面也至关重要，但其机制仍不清楚。我们的研究表明，微生物群通过降解PM损伤诱导的3-HK从而对PM起到保护作用。3-HK增加了卵动蛋白体和卵囊的数量，但没有增加外鞭毛率，这表明它假定的作用是损害中肠屏障功能，而不是寄生虫的发育。在我们的随访研究中，我们证明3-HK通过抑制Per1的表达进而损害PM的完整性。因此，3-HK通过损害PM结构进而增加柏氏疟原虫的感染是合理的。我们首先使用抗生素来处理蚊子，以探究蚊子的微生物菌群在Trp代谢中作用。虽然说抗生素（包括青霉素、链霉素和庆大霉素）通常用于清除蚊子的微生物菌群，但已有的研究表明，动物长期暴露于这些以及其他抗生素可以诱导生殖损伤、线粒体功能障碍以及氧化损伤。但是它们对蚊子的直接影响仍有待确定。通过对虫卵进行表面灭菌同时所有发育阶段均在无菌环境中饲养能够产生无菌伊蚊，但无菌按蚊幼虫未能成熟发育到成虫期。开发无菌按蚊模型是未来研究微生物菌群与蚊子串扰的替代方法。在伊蚊中，与无菌蚊子相比，正常蚊子微生物群的定植与无菌蚊子中对蚊子的转录组具有有限的影响。然而，多个差异调控基因与代谢相关，这表明微生物菌群对蚊子的代谢方面具有影响。不同蚊子种类、以及他们的生活环境和、饮食构成都可能导致蚊子的微生物菌群产生不同的调节作用。为了验证肠道菌群参与了Trp代谢，随后我们分析了斯氏按蚊的种群结构，并利用包括基因组测序、代谢组学分析和基因突变在内的多种实验方法证明了产碱假单胞菌参与了3-HK的分解代谢。进一步，我们验证了产碱假单胞菌通过分解代谢3-HK保护蚊子PM。因此，我们的结果证明微生物介导的3-HK的分解代谢可以保护蚊子的PM，增强了蚊子抵抗疟原虫感染的能力。然而，3-HK调控Per1表达的机制仍不清楚。除了影响主要PM蛋白的表达，3-HK可能通过其他未知机制损害PM结构。本研究中，在蚊子生理浓度下补充XA未能促进寄生虫的感染。其原因可能是当斯氏按蚊在感染柏氏疟原虫24 h后，喂食蚊子的XA可能会失去其原本的作用。假单胞菌普遍存在与许多蚊子物种中。我们证明产碱假单胞菌通过促进3-HK的分解代谢有助于抵御疟原虫的侵袭。KynU负责3-HK降解。但我们在体内未检测到下游产物CA，这可能是由于其丰度较低导致。在血餐后，我们在被清除掉微生物的蚊子和正常按蚊之间也没有观察到CA水平的差异。CA的产生可能由蚊子和微生物群基因共同介导的。微生物菌群的消除可能促进了CA由蚊子这一途径进行合成。无论是外源性补充3-HAA还是补充CA对斯氏按蚊疟原虫感染均无影响，进一步表明产碱假单胞菌在保护PM中的作用。尽管与野生型相比，KynU突变降低了产碱假单胞菌对柏氏假单胞菌感染的抑制作用，但与抗生素处理相比，其定植仍增加了蚊子对寄生虫的耐药性。这些结果，产碱假单胞菌在抑制柏氏假单胞菌感染中起的双重作用--通过降解毒性3-HK以及增强蚊子免疫反应从而保护PM。综上所述，我们的分析证明了由肠道菌群调节的蚊子色氨酸代谢如何影响中肠屏障功能和载体能力。调节细菌和蚊子中的色氨酸代谢途径可能代表了蚊子调控的新策略。
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