小鼠自发胰腺癌模型

外科黄文斌 2022-12-06 发布于广东

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1.KPP 小鼠

KrasLSLG12D from Tyler Jacks (Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA), p16/p19fl/fl from Anton Berns (NKI, Amsterdam, the Netherlands), and Pdx1.Cre from Andy Lowy (University of Ohio, Columbus, OH). KPP mice were generated as described previously.

Aguirre, A. J. et al. Activated Kras and Ink4a/Arf deficiency cooperate to produce metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes Dev. 17, 3112–3126 (2003).
Dominguez, C. X. et al. Single-Cell RNA Sequencing Reveals Stromal Evolution into LRRC15 Myofibroblasts as a Determinant of Patient Response to Cancer Immunotherapy. Cancer Discovery 10, 232–253 (2020).

1.1 p16/p19

p16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株纯发现有纯合子缺失，突变，认为是比p53更重要的一种新型抗癌基因。有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。

P16基因已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现纯合子缺失以及无义，错义及移码突变，表明p16基因以缺失，突变方式广泛参与肿瘤形成，检测p16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。

参考资料：p16（(https://baike.baidu.com/item/P16%E5%9F%BA%E5%9B%A0/3120063)）

1.2 KrasLSLG12D

品系描述

野生型Kras激活/失活效应是受控的，而突变型Kras蛋白功能异常，持续处于激活状态，导致肿瘤细胞的持续增殖。将loxp-stop-loxp以及含有G12D的exon2替换Kras的exon2，建立Kras基因G12D条件性点突变小鼠品系，该小鼠与Cre小鼠交配后可获得G12D点突变小鼠。Kras(LSL-G12Ｄ/LSL-G12D);纯合子胚胎期即发生死亡。

参考资料：Kras-LSL-G12D（
(https://www./portal/article/index/id/3579/post_type/3.html)
）

2.KPC小鼠（国内公司可以直接买到）

LSL-KrasG12D/ ;Trp53R172H/ or Trp53loxP/loxP Pdx1-Cre)

2.1 小鼠描述

KPC小鼠是目前成功建立的一种胰腺导管腺癌模型小鼠，具有很多与人胰腺癌相似的特点，如胰腺内皮细胞瘤形成，强烈的免疫反应。80%的KPC小鼠出现了肝转移和肺转移的现象。KPC小鼠包含了KRAS和TP53基因突变，而在人胰腺癌的研究中发现，分别有80%和70%的患者表达这两种突变蛋白。KPC小鼠的P53基因含有一个显性抑制性点突变（ TP53R172H ），KRAS基因含有一个条件性活化点突变（KRASG12D）。KRAS突变基因的上游含有lox-stop-lox终止序列，其在没有cre重组酶的条件下是不表达的。将Cre重组酶连接到PDX1的启动子后，其将在胰腺的腺泡、胰岛和导管中表达。在Cre介导的基因重组中，突变的KRAS基因含有的lox-stop-lox终止序列被切除，从而可在胰腺中表达KRASG12D蛋白。通过Trp53-R172H (NM-KI-18028)、Kras-LSL-G12D (NM-KI-190003)和Pdx1-Cre-Tg交配获得。

「品系详情」

此KPC品系为他莫昔芬诱导胰腺导管腺癌(PDAC)模型小鼠，携带Kras LSL G12D (Krastm4Tyj)等位基因、Trp53tm1Brn floxed等位基因和Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam转基因。KPC品系小鼠在他莫昔芬给药后8-10周内出现腺泡导管化生和胰腺上皮内瘤变(PanIN)，并在14-16周内进展为浸润性胰腺导管腺癌。其时程和转移扩散（至肝、肺、腹膜壁层和隔膜）与在PDAC的KPC模型中观察到的表型相似。胰腺组织学分析显示，其多灶性肿瘤类型与KPC模型中所见的肿瘤类型相同。

Kras**tm4Tyj等位基因[KrasLSL-G12D]包含点突变(G12D)，但是因为存在loxP终止密码子，该突变表达受阻。此Kras**tm4Tyj等位基因纯合小鼠会出现宫内死亡。Cre 介导的重组可以切除终止密码子，使致癌蛋白得以表达。

Trp53**tm1Brn等位基因[p53LoxP]在P53基因2至10号外显子的两侧包含LoxP位点。Trp53**tm1Brn等位基因纯合小鼠生育能力虽有所降低，但仍可育种。Cre介导的 floxed序列缺失会导致等位基因敲除。

Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam 转基因[Pdx1-CreER]具有小鼠Pdx1启动子，能够表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶（Cre-ERTM；Cre重组酶与小鼠雌激素受体配体结合域的 G525R 突变体融合）。

参考资料：1.KPC小鼠（(https://www./portal/article/index/id/12755/post_type/3.html)）
Hingorani, S. R. et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell 7, 469–483 (2005).

3. KPPF小鼠

Specific deletion of Col1 in aSMA myofibroblasts decreases Col1 protein in autochthonous model of PDAC

研究使用Flp-FRT系统、Cre-loxP系统分别诱导了两个Kras表达且p53丢失的小鼠家系（KPPF小鼠和KPPC小鼠），将两个家系结合，并利用双同源重组报告系统，研究者用EGFP和tdTomato分别标记了Pdx1谱系的癌细胞和α-SMA阳性的肌成纤维细胞，并观察到随着疾病进展，Col1在胰腺组织中的沉积量逐渐增加。此外，作者对KPPF小鼠胰腺肿瘤的活细胞混合物进行了单细胞转录组分析，再次验证了成纤维细胞是KPPF小鼠Col1的主要贡献者.

I型胶原(Col1)已经被许多研究人员报道为PDAC基质中沉积的细胞外基质(ECM)的重要组成部分，本研究采用双重组酶系统小鼠模型揭示了COL1在自发PDAC中的功能，肌成纤维细胞产生的Col1在PDAC的总Col1含量中起重要作用，且肌成纤维细胞中Col1的缺失与MDSCs数量的增加、T/B淋巴细胞的减少和抑制相关。

参考资料：
1.αSMA 肌成纤维细胞中I型胶原缺失增强免疫抑制（(https://m.thepaper.cn/baijiahao_11626164)）
Chen, Y. et al. Type I collagen deletion in αSMA myofibroblasts augments immune suppression and accelerates progression of pancreatic cancer. Cancer Cell 39, 548-565.e6 (2021). 这篇文献中还提到另外一种自发胰腺癌模型:PKT mice (LSL-KrasG12D/ ;Tgfbr2loxP/loxP;P48Cre).
3.Chytil, A., Magnuson, M. A., Wright, C. V. E. & Moses, H. L. Conditional inactivation of the TGF-β type II receptor using Cre:Lox. genesis 32, 73–75 (2002).

导师布置了一篇文献解读

LRRC15 myofibroblasts dictate the stromal setpoint to suppress tumour immunity. Nature (2022).

这个工作是18年 Nature和2020年Cancer Discovery工作的延续

TGFβ attenuaes tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature 554, 544–548 (2018).
Single-Cell RNA Sequencing Reveals Stromal Evolution into LRRC15 Myofibroblasts as a Determinant of Patient Response to Cancer Immunotherapy. Cancer Discovery 10, 232–253 (2020). ）的一个延续性工作。

里面用的是胰腺癌的模型，关注的是成纤维细胞对免疫功能的影响。这篇和TGFβ这两篇是是对文献背景知识的学习帖子