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各位老师，大家好！我是“一麦众承”第7组——'风吹麦浪’的组员关攀锋，今天代表小组值日。我们的组长是中国农科院作物科学研究所徐兆师研究员，本组还有陈金平老师、王紫娟老师、闵东红老师、张强老师、王林生老师、靳一兵老师、翟会杰老师、徐登安老师、孙爱清老师、王树星老师。非常感谢“一麦众承”学习交流平台，得以有机会向各位老师学习交流。本次值日内容是普通小麦籽粒叶黄素含量变异与遗传特性分析，是与山西农业大学小麦研究所郑军老师一起开展的部分研究工作。希望分享的内容对大家的育种工作能有所帮助，不足之处敬请各位老师多多批评指正。
叶黄素是一种广泛存在于植物中的类胡萝卜素，人体自身无法合成，只能通过食物摄入。叶黄素又名“眼黄金”，是人类视网膜中最重要的营养物质，具有保护人体视力、抗癌、抗氧化、延缓早期动脉硬化、预防衰老等功能。叶黄素是类胡萝卜素的主要成分, 约占类胡萝卜素总量的70% - 95%；而类胡萝卜素又是构成小麦籽粒黄色素的主要成分。小麦籽粒黄色素含量是影响面粉及面制品颜色和营养品质的重要因素，对其进行遗传改良已成为小麦品质改良和叶黄素生物强化营养功能育种的重要内容。
一、小麦籽粒黄色素（叶黄素）含量的测定
目前，小麦籽粒黄色素的测定广泛采用美国谷物化学协会（American Association for Cereal Chemistry,AACC）公布的标准方法AACC 14-50，主要以分光光度法测定黄色素含量[1]，但是该法检测通量低，只能对样本逐个检测，操作繁琐，工作量大，测定时间长，检测效率低，所需样本试剂量大。近期山东省农业科学院作物研究所刘建军老师团队公布了一种可代替传统 AACC 14-50 法用于大规模样本黄色素含量测定的酶标仪改良法[2]。分光光度法和酶标法测量的黄色素含量主要是面粉中类胡萝卜素含量的总量，包括叶黄素和非叶黄素的类胡萝卜素。
而对叶黄素组分的测定，目前使用比较广泛的是高效液相色谱法（High performance liquid chromatography, HPLC）和超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)法（中国农业科学院作物科学研究所何中虎团队建立了UPLC测定类胡萝卜素组分的技术体系）[3]，这两种方法具有较高的精确性，且稳定性好，能够高效、快速的检测样品中叶黄素含量。本研究是利用HPLC法结合叶黄素标准品结果对小麦籽粒中的叶黄素成份进行了定量分析。如图1所示，HPLC法测定叶黄素标准品，保留时间约3.23分钟，色谱图基线平稳，标品峰形较好，无明显拖尾; 采用改良的有机浸提法提取的小麦籽粒叶黄素在 HPLC 测定中保留时间与标品一致[4]。 图1 HPLC色谱图及差异品种的面粉实物图
(A) 不同浓度标样的HPLC峰图; (B) 小麦样品HPLC峰图; (C) 面粉实物图
二、小麦籽粒叶黄素含量的变异分布
以262份中国小麦微核心种质（MCC）为材料，利用HPLC法进行了两年3个不同环境下籽粒叶黄素含量的测定与分析，发现不同品种间叶黄素含量变异范围较广（表1），3个环境下叶黄素含量范围分别为1.05 - 6.35 μg/g、0.87 - 8.74 μg/g和1.18 - 8.90 μg/g。其中在3个环境下叶黄素含量的平均值均大于5.00 μg/g的品种共有10份，分别是春麦、洛夫林10号、中农28、红粒红春麦、白粒红春麦、铭贤169、本地黄花麦、日喀则54号、牛趾甲和老麦 [5]。此外，也对194 份山西小麦品种的籽粒叶黄素含量进行了测定，筛选到3份高叶黄素含量品种，分别是河东TX-006、晋麦 95号和临远3158[4]。以上材料为选育高含量叶黄素小麦品种提供了种质资源。
表1 不同小麦品种按照籽粒叶黄素含量分组 三、地域分布对小麦籽粒叶黄素含量的影响
通过分析我国小麦微核心种质材料中不同地域选育品种的叶黄素含量（图2），发现不同麦区选育的小麦品种叶黄素含量在地域分布上具有明显的差异性。其中新疆冬春麦区叶黄素含量均值最高，青藏冬春麦区次之，华南冬麦区叶黄素含量均值最低，西南冬麦区和北部春麦区叶黄素含量均值也高于3.00 μg/g。北部冬麦区叶黄素含量接近3.00 μg/g，长江中下游冬麦区叶黄素含量与东北春麦区差异较小。此外，新疆冬春麦区和青藏冬春麦区叶黄素含量高于4.00 μg/g的品种分别占27.30 %和18.20 %，北部冬麦区占9.10 %，而黄淮冬麦区、长江中下游冬麦区和华南冬麦区没有叶黄素含量高于4.00 μg/g的品种，中国西北部麦区选育品种中高叶黄素含量品种整体高于东南部麦区。 图2各生态区域小麦籽粒叶黄素含量的频率分布
注：Ⅰ：北部冬麦区；Ⅱ：黄淮冬麦区；Ⅲ：长江中下游冬麦区；Ⅳ：西南冬麦区；Ⅴ：华南冬麦区；Ⅵ：东北春麦区；Ⅶ：北部春麦区；Ⅷ：西北春麦区；Ⅸ：青藏春冬麦区；Ⅹ：新疆冬春麦区
四、种质类型对小麦籽粒叶黄素含量的影响
中国小麦微核心种质包括地方种、育成品种和国外引进品种，如图3A所示，地方种叶黄素含量均值为2.90 ± 0.80 μg/g，育成品种含量均值为2.73 ± 0.85 μg/g，两者没有显著差异。春小麦和冬小麦叶黄素含量分别为2.87 ± 0.86 μg/g，2.83 ± 0.83 μg/g，两者之间叶黄素含量差异也不显著（图3B）。小麦籽粒种皮最常见的颜色有红色和白色，分析发现红粒小麦叶黄素平均含量为2.94 ± 0.81 μg/g，白粒小麦2.69 ± 0.82 μg/g（图3C），红粒小麦和白粒小麦的叶黄素含量无显著差异，说明籽粒颜色对叶黄素含量影响不大，籽粒颜色不能作为高叶黄素选育指标。此外，研究选育年份对叶黄素含量的影响，发现不同育成年代小麦叶黄素含量并未发生有规律的变化（图3D）。随着育成年份变化，产量性状如穗粒数和千粒重一直在增加，而叶黄素含量差异不明显，说明无论是早期地方种还是育成品种，叶黄素含量在育种过程中没有经过强烈的人工选择。 图3不同种质类型特点小麦叶黄素含量的比较
注：（A）地方种、育成品种和国外引进品种比较; （B）冬春性; （C）籽粒颜色（D）育成年份
五、主要农艺性状与籽粒叶黄素含量的相关性
关于农艺性状对叶黄素影响的研究较少，只有千粒重与叶黄素含量呈负相关的报道。将小麦籽粒相关性状分解为粒长、粒宽和粒厚，分析其与叶黄素含量的相关性发现，叶黄素含量与千粒重在3种环境下呈显著负相关，与粒长在E2环境呈极显著正相关，在E1和BLUP中呈显著正相关，叶黄素含量与粒宽和粒厚无明显相关性。将叶黄素含量与株高、穗长和小穗数等7个农艺性状进行相关性分析，发现叶黄素含量与有效分蘖数、成熟期、株高、穗长和小穗数等主要农艺性状均无相关性，仅有穗粒数和抽穗期在单个环境中显著相关，说明在基本正常的生长条件下，所考察的农艺性状对小麦叶黄素含量影响较小（表2）。
表2 小麦籽粒叶黄素含量与主要农艺性状的相关性
注：*和**分别表示0.05和0.01水平差异显著
六、小麦籽粒叶黄素含量的遗传特性分析
在前期研究中，通常用黄色素含量和黄色素指数等间接参数来评估小麦籽粒类胡萝卜素的含量，并进行遗传分析[2, 7]。本研究利用HPLC法直接对叶黄素这一代谢产物进行定量表型测定，结合全基因组关联分析和连锁分析挖掘控制小麦籽粒叶黄素含量主要遗传位点[6]。关联分析使用的材料是中国小麦微核心种质（MCC），连锁分析是利用晋春 7号和临1219衍生的DH系群体，基因型数据是利用小麦90K SNP芯片的分型结果。分别在三个不同环境下对MCC群体（E1、E2、E3和BLUP）和DH群体（E4、E5、E6和BLUP）进行了表型鉴定和广义遗传力分析。中国小麦微核心种质和DH群体的广义遗传力数值分别为0.80和0.88，表明叶黄素含量主要受遗传因素影响。
如表3所示，关联分析在2AL、2DS、3BL、3DL、7AL和7BS染色体上鉴定到6个与叶黄素含量相关的稳定QTL位点（至少在两个环境和BLUP均能检测到的QTL）；连锁分析在1A（2个）、2B、5A（4个）、5D和6A（2个）染色体上检测到10个与叶黄素含量相关的QTL，可解释5.15 - 10.86%的表型变异，其中Qluc.5A.1、Qluc.5A.2 和QLuc.6A.2为环境稳定QTL，增效等位基因均来自亲本临1219，并且QLuc.6A.2位点在关联群体中也可以检测到[6]。
表3 MCC和DH群体中鉴定到的叶黄素含量稳定QTL
利用鉴定的稳定QTL，进一步分析遗传位点的累加效应，如图4所示，发现在微核心种质中，小麦籽粒叶黄素含量与优异等位基因的数目正相关，且叶黄素含量随优异等位变异数的增加而增加，表明自然群体中叶黄素含量受到这些稳定QTL/位点的加性效应影响。同样，在DH群体中利用3个稳定 QTL（QLuc.5A.1、Qluc.5A.2和QLuc.6A.2） 进行加性效应分析，结果表明随着优异等位基因的累加，叶黄素含量不断增加（图4）。因此，在未来小麦育种中，利用与这些QTL位点紧密连锁的分子标记进行辅助选择育种，可有效加快优异等位基因的聚合。 图4 MCC群体（A和B）和DH群体（C和D）中QTL加性效应分析及（E）济麦22（含有2个优异等位变异）与（F）中农28（含有6个优异等位变异）小麦粉颜色比较
七、小结与讨论
在我国传统饮食中，消费者普遍青睐细腻洁白的面粉制作的馒头、 面条、包子和水饺等，而在日本和东南亚等国家，消费者偏爱呈亮黄色的黄碱面条，提高小麦籽粒黄色素含量已成为这些国家的一个重要育种目标。因此，根据不同的市场和消费者需求，对面粉及其制品颜色性状和营养品质进行改良是小麦品质改良的重要内容，也是功能性小麦育种的一个重要方向。本研究主要利用HPLC法对中国小麦微核心种质中籽粒叶黄素含量进行了定量分析和遗传分析，挖掘到与叶黄素含量显著相关的数量性状位点，开发紧密连锁的分子标记，以期应用于分子标记辅助选择育种，提高育种效率。但是叶黄素作为次级代谢产物，调控机理比较复杂[7-8]，加之自身知识有限，很多不当之处，还望各位老师见谅，多多批评指正！
在高叶黄素小麦育种方面，2021年11月山东省农作物品种审定委员会审定了两个高叶黄素小麦品种“山农48”（鲁审麦20216042）和“济麦8040”（鲁审麦20216043）。“山农48”（品种来源：原试验名称山农25333，系A075-4与济麦22杂交后选育）是山东农业大学孔令让教授团队主持选育的小麦新品种，是国内第一个携带抗赤霉病基因FHB7的小麦品种，2021年经武汉迈特维尔生物科技有限公司测试，叶黄素含量12.8微克/克，是济麦22号叶黄素含量的3.59倍。济麦8040系山东省农业科学院作物研究所郭军老师选育的富含叶黄素小麦新品种（图5）；2014年以泰农18为母本，以F1[泰农18/RL6040(高叶黄素含量)]为父本进行常规有性杂交，经温室加代、系谱法单株、单穗选择和分子标记辅助选择，于2018年育成，2021年11月通过山东省审定。 图5济麦22和济麦8040制作的面条比较
（图片来自山东省农业科学院作物研究所网站http://www./Achievement/View/10241/12447）
最后，恭祝各位老师身体健康，工作顺利，阖家幸福，万事如意！
作者简介：关攀锋，男，农学博士，硕士研究生导师。2018年6月博士毕业于中国农业大学作物遗传育种专业，留校做博士后研究，2020年12月博士后出站直聘郑州大学农学院副研究员岗。目前主要从事小麦重要农艺性状的基因/QTL定位及优异等位基因发掘与分子设计育种。先后主持国家自然科学基金青年项目、中国博士后基金面上项目、省部共建有机旱作农业国家重点实验室开放基金等课题。近五年以第一作者或共同一作发表研究论文十余篇；以第二排名作者获得发明专利2项。
联系方式：13101716907；邮箱：guanpanfeng@zzu.edu.cn
主要参考文献：
[1] American Association of Cereal Chemists International 2000. Approved Methods of AACC. Method 14-50. AACCI: St. Paul, MN, 2000: 14-50
[2] 翟胜男, 刘爱峰, 李法计, 刘成, 郭军, 韩冉, 訾妍, 汪晓璐, 吕莹莹, 刘建军. (2021). 小麦籽粒黄色素含量检测方法的改良与应用. 中国农业科学, 54(2), 9.
[3] 李文爽, 夏先春, 何中虎. (2016). 普通小麦类胡萝卜素组分的超高效液相色谱分离方法. 作物学报, 42(5), 8.
[4] 武棒棒, 李晓华, 关攀锋, 杨淑斌, 黄雨茜, 郑兴卫, 赵佳佳, 乔玲, 张娟, 刘维仲. (2022). 小麦籽粒叶黄素含量变异及遗传特性分析. 植物学报, DOI: 10.11983/CBB22081.
[5] XiaoHua Li, PanFeng Guan, Sen Huang, XingWei Zheng, BangBang Wu, JiaJia Zhao, Ling Qiao, PingYi Guo, Jun Zheng (2022). Evaluation and genetic variation of lutein content in Chinese common wheat. Journal of Cereal Science, 108, 103545.
[6] Panfeng Guan, Xiaohua Li, Lei Zhuang, Bangbang Wu, Jinyong Huang, Jiajia Zhao, Ling Qiao, Jun Zheng, Chenyang Hao, Xingwei Zheng (2022). Genetic dissection of lutein content in common wheat via association and linkage mapping. Theoretical and Applied Genetics, 135(9), 3127-3141.
[7] Shengnan Zhai, Xianchun Xia, Zhonghu He. Carotenoids in Staple Cereals: Metabolism, Regulation, and Genetic Manipulation. Frontiers in Plant Science. 2016 Aug 10;7:1197.
[8] Yan Zhao, Haiyan Sun, Yingying Wang, Yanyan Pu, Fanmei Kong, Sishen Li (2013). QTL mapping for the color, carotenoids and polyphenol oxidase activity of flour in recombinant inbred lines of wheat. Australian Journal of Crop ence, 7(3), 328-337.
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