 之前写过一篇培养细胞的文章，被我删除了，因为部分有误，这一次的，比较靠谱，有参考价值。 参考文献：刘斌等，细胞培养，第三版。 正文 细胞复苏 概述 复苏细胞要快，快速解冻，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。 用品 培养液（复苏细胞一般用血清浓度为20%培养基），吸管，离心管，培养瓶，水浴锅（提前预热）。 步骤 (1)快速解冻细胞：将冻存管从液氮罐中取出，直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容物尽快融化。如果冻存管封闭不严，在保存过程中液氮进入其中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，因此，必要时要做好防护：存取冻存管时都要佩戴防护眼镜和手套，冻存管投人存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上，以防发生意外。 (2)加培养基+离心：从37 ℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加完全培养液混合后低速离心，除去上清液。必要时再重复用完全培养液漂离心洗1次。 离心方式：800~1000转/分钟，离心3~5分钟。 培养基加多少：1~10倍体积，一般加1倍，比如1毫升细胞悬液+1毫升培养基。 (3)重悬细胞+培养：用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入 CO₂培养箱静置培养，次日更换1 次培养液，继续培养。细胞复苏时细胞数可以做适当稀释，接种细胞密度以5x10e5/mL为宜。 注意：一般先用1毫升培养基，轻轻吹打细胞沉淀，吹打均匀，再加剩余的培养基放入温箱。 细胞换液 物品：移液枪，吸管，PBS（必要时），培养基。 步骤：1.吸出旧的培养基；2.必要时PBS洗2~3次；3.加入新的培养基。 时机：营养液变黄（酸性代谢产物增多，PH下降，营养液快消耗完了，营养液由桃红色变为淡黄色）；一般2~3天换液1次，生长缓慢的细胞3~4天换一次，没有统一的标准。 细胞传代 原因：细胞长满培养瓶，不传代的话，就会死。 1.判断死活：把培养小罐拿出来，显微镜偷窥，细胞死了就可以下班了。圆形的细胞，一般就是死球了；张牙舞爪的才是活的。 2.丢弃原培养基：吸走原来的培养基（没有营养了，只有代谢废物，就是细胞的尿液和屁）。 3.PBS大清洗：冲洗2次左右，把原来培养基的残余势力给全部清除，另外，培养基会降低胰酶的功力。 4.裂开细胞：0.05%trypsin大约1ml，裂开细胞，棒打鸳鸯，让抱团取暖的、躺平粘在瓶底的细胞离别成单个光棍细胞。37度温箱，1.5~2分钟左右（然后显微镜观察细胞的消化情况，据情况调整时间）。然后吹打细胞（培养瓶的每个角落都要吹打，尽量避免气泡），让他们彻底成为一盘散沙。 5.终止分裂：尽快加入培养基，终止trypsin的七伤拳。培养基的量：trypsin的2倍左右。 6.离心机（可选）：必要时，或者闲着没事干，800转左右，离心3~5分钟，吸走上清液，彻底清除胰酶的七伤拳。 7.三国演义：把细胞平均分成3份左右，分装在新的培养瓶。按照瓶子大小（T25号4~5ml），加入培养基（10~20%FBS+双抗）。 8.培养：摇匀（然后显微镜偷窥）。放入温箱（37度，5%CO2），让他们自生自灭。 细胞冻存 先把冻存液配好！细胞计数器消毒（也可以不消毒）！冻存管！ 细胞冻存液:70% 培养基 + 20% FBS + 10% DMSO（二甲基亚砜，DiMethyl SulfOxide） 1.消化细胞：去除培养基，PBS洗3~5次，0.05%胰蛋白酶消化细胞，37度培养箱1.5~3分钟，然后加入2倍体积培养基终止消化。 2.离心：800~1000转/分钟，离心3~5分钟，去除上清液。 3.重悬：细胞冻存液（70% 培养基 + 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，吹打均匀，密度为5~10×106个/ml，每管1毫升（25号培养瓶搞2管左右），标记。 4.冻存：细胞冻存盒+异丙醇，先放-80度过夜，然后放入液氮罐。 备注：先把程序降温盒放常温，看看里面的异丙醇到不到刻度，不到要补够（总量250ml）。冻存液不用加抗生素。 细胞铺板 原因：把细胞分成多份，为后续研究做准备，过程和细胞传代一样。具体铺多少，根据研究目标决定。细胞铺板以后，只能使用，不能传代了。 1.清洗+裂开细胞：PBS清洗两三次，加入胰酶1mL裂开细胞大约2分钟，加入培养基终止胰酶的七伤拳，离心细胞，丢弃上清液。 2.测细胞浓度：再次加入培养基1毫升吹打细胞（加多了反而不好把细胞吹打均匀），然后加入2毫升，轻轻地，吹打液体，让细胞均匀的分布在溶液中，在玻片上滴入10~20ul细胞液测细胞浓度！ 3.铺板浓度：每个培养孔的细胞浓度都要相同，铺板浓度为2～8×10e4/ml。 比如，测量下来，细胞浓度为1×10e6 = 100×10e4/ml。设定所有孔的浓度为5×10的4次方／mL，那么稀释20倍就可以啦。 假如每个孔放1毫升营养液，就是1000微升，那么，加入950微升营养液+50微升之前的细胞液体。 4.收工：按照培养小罐的体积加入培养基，把培养基摇匀，放入37度培养箱。 病毒滴度测定 准备：检测前一天，将293A细胞铺板于48孔板中，3.0-8.0 × 104/孔。 1.配制培养基：DMEN培养基+FBS（胎牛血清）+Polybrene+双抗生素，让FBS的浓度为10~20%，Polybrene在原来的基础上稀释2000倍，让工作浓度为2~10ug/ml。 2.分装培养基：按照培养瓶的要求，每个孔加入相应体积的培养基。48孔板，加270μLDMEM培养液（含polybrene）。 3.加入病毒：慢病毒稀释2倍。加30 μL病毒原液于第一个EP管中，充分混匀，从中再取30 μL加入下一管EP。依次进行梯度稀释至10万倍。 4.门诊随访：24小时后，PBS洗出含病毒的培养基（用吸管吸入离心管，放入专门的黄色垃圾袋处理），换入新的培养基。 48小时后，拍照，看看免疫荧光情况。 72小时后，拍照，看看免疫荧光情况。换入新的培养基。 5.滴度计算方法： Virus Titer = cell numbers (of EGFP)× dilution factor/volume (ml) = Titer/ml 例如：10-6孔有六个荧光，即Virus Titer=6 × 106 /0.25 (ml) = 2.4 × 107 /ml 慢病毒感染靶细胞 1.铺板：感染前12-18h，将靶细胞铺板于6-孔板上（含10% FBS的DMEM培养基培养），第二天感染前，不超过40%-50%的细胞融合。 2.冻融病毒：轻轻混合冻融的病毒液，不要涡旋。虽然浓缩试剂可保持冻融后的病毒活性，亦应注意避免使用反复冻融的病毒液。 3.配置感染试剂：根据靶细胞的培养液的量调节病毒和聚凝胺（polybrene）的添加量。病毒感染过程中聚凝胺（polybrene）的最终浓度5-10µg/ml（根据不同细胞而不同，推荐使用5µg/ml）。 4.转染：在靶细胞中加入病毒悬液，感染8-24h。 5.换液：感染8小时左右后，移除丢弃存留病毒的感染培养液，换成新鲜的生长培养液。注意：废弃的培养液包含可感染的慢病毒。所有接触慢病毒的物品，最后均需要灭活处理再丢弃。 6.培养：继续培养细胞24-48h，在靶细胞中积累基因产物。 7.收集细胞：收集细胞进行分析，或者puromycine抗生素再进行筛选。 收集细胞：核酸篇 培养平板最好放置冰上，加入裂解液（6孔板加1毫升），吹打培养皿的底部，把细胞吹起来，然后吸入EP管，放置冰上，全部操作完成后，-80度保存备用。 收集细胞：蛋白质 1.照射荧光：转染病毒且换液后72小时后看看荧光情况，初步了解细胞有没有转染病毒，没有荧光基本上可以丢了。 2.配置裂解液：蛋白质裂解液mRIPPA+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂，旋涡震荡5秒，然后放在冰上。六孔板每孔200~300ul，最好多配100~500ul，因为后面要稀释蛋白质浓度。 3.裂开：培养皿尽量放冰上，加入混合裂解液，冰上放置5分钟以上，然后用干净的细胞刮将细胞刮下（上下左右东西南北四面八方都尽量刮到），用移液枪收集细胞放入1.5ml的EP管内，放置冰上待离心。 4.离心：提前预冷4°离心机，蛋白质样品旋涡震荡5分钟，12000rpm（或g）离心5~15min。 5.收集：将离心后的上清转移至新的EP管内，做好标记，若不进行蛋白质定量，于-80°冰箱长期保存。 6.BCA测蛋白质浓度 6.1配液：配置工作液，A液与B液的比例为50：1，配置好后旋涡震荡5秒以上，放冰上。 96孔板，每孔100ul。 假如10个样品，一个副孔，就是20*100=2000ul。 标准品减半稀释6次，浓度分别为：1倍，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，总共7个孔，加上1个副孔，总共14孔，就是：14*100=1400ul。 总共的液体就是2000+1400。 6.2加液：样本量与工作液的比例为20：1，每个孔加95ul工作液，5ul蛋白质。 6.3孵育：加样完成，37度孵育30分钟。 6.4测浓度：放入机器测浓度，先开机，再打开软件。96孔板的A对着机器的A，盖子不能放进去。按照机器的模式测浓度，绘制标准曲线，按照浓度最小的管子，把所有的管子的浓度稀释成一样的（尽量用混合裂解液稀释，没有么用ddH2O稀释）。浓度最小的管子，投入的体积=体积最小的管子。剩余的样品放-80度冰箱。 7.配置WB上样液：加入蛋白质loading，95度煮5~10分钟，-20度保存。假如是5×的loading，loading的量就是蛋白质体积的1/4，6×的就是1/5。 细胞的传代培养 |
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