【原】细胞外囊泡：外泌体和外切体

细胞外囊泡(ev)是由细胞自然释放的纳米级囊泡，由脂质双分子层分隔，不能复制(Van Niel等，2018)。越来越多的证据显示，细胞外囊泡通过将生物活性分子(包括核酸、蛋白质和脂类)从供体细胞转移到受体细胞，在细胞间通信中具有重要作用(Mathieu等人，2019年)。从那时起，细胞外囊泡已被证明与生理和病理过程有关(Shah等人，2018年;Yáñez- Mó等，2015)。最近，细胞外囊泡正在扮演病毒传播的游戏制造者的新角色。例如，已发现非包膜甲型肝炎病毒(HAV)利用细胞外囊泡的生物发生途径，特别是ESCRT蛋白，以包膜状态离开细胞(Feng et al.， 2013)。据报道，另一种非包膜戊型肝炎病毒(HEV)也存在于细胞外囊泡内，并以包膜状态释放(Nagashima等人，2014年)。此外，细胞外囊泡包装的肠道病毒感染宿主细胞的效率比游离病毒颗粒更高(Chen et al.， 2015)。其他类型的病毒利用细胞外囊泡作为病毒传播途径已经在其他地方进行了全面审查(Alenquer & Amorim, 2015;Altan-Bonnet, 2016;Urbanelli等人，2019)。

极化分泌

是经典突触的标志，也是免疫突触的定义特征之一(Dustin & Colman 2002, Poo et al. 1988)。极化分泌在效应T细胞中得到了特别充分的研究，细胞毒性T细胞从大分泌溶酶体释放预先储存的穿孔素和颗粒酶，辅助性T细胞释放多种调节免疫应答的细胞因子。

细胞溶解性T细胞中的分泌颗粒

CD8+细胞毒性T细胞通过两种不同的机制杀伤:(a)储存在溶酶体样室中的穿孔素和颗粒酶B的Ca2+依赖性分泌和(b) Fas配体的Ca2+非依赖性表达。细胞毒性T细胞容易与靶细胞形成免疫突触，并将颗粒释放到明确的分泌域(Stinchcombe等人2006)，但MTOC极化的成熟免疫突触形成可能并不总是靶细胞杀伤所必需的(Bertrand等人2013,Purbhoo等人2004)。TCR信号体具有足突体的特征，足突体是其他细胞类型的分泌专一性(Kumari et al. 2015, Sage et al. 2012)。无论是否需要突触和MTOC的重新定位，颗粒的释放都受到高度调节，并且似乎涉及一个启动步骤，该步骤涉及将蛋白质从早期的核内体隔室运送到质膜(Marshall等，2015)。免疫突触中的皮质f -肌动蛋白如何调节定向分泌也有兴趣。在类天然NK细胞中，有证据表明存在一个稀疏的皮质f -肌动蛋白网络，该网络具有足够大的孔，使颗粒能够通过(Brown等，2012)，这类似于神经元中的突触网格的概念。相比之下，更广泛的f -肌动蛋白清除可能发生在细胞毒性T细胞突触(Ritter et al. 2015)。细胞因子分泌型CD4+辅助性T细胞似乎不像细胞毒性T细胞那样将细胞因子储存在颗粒中。相反，辅助性T细胞通过极化或非极化途径组成性地释放它们产生的细胞因子。基于高尔基体与突触的邻近，极化分泌的间接证据受到质疑，因为在极化途径中分泌的蛋白和在非极化途径中分泌的蛋白都通过高尔基体。Janeway及其同事使用了一种模型系统，该系统将T细胞捕获在过滤器中，将抗cd3传递到一侧，并注意到IL-4优先聚集在过滤器的同一侧(Poo et al. 1988)。一种基于对刺激性底物精确应用细胞因子捕获和检测的替代方法表明，干扰素-γ (IFN-γ)也以极化方式从辅助性T细胞释放，但TNF和趋化因子以非极化方式释放(Huse等人2006)。在病毒性脑膜炎的情况下，细胞毒性T细胞的非定向释放趋化因子可通过招募粒-单核细胞来增强免疫病理(Kim等，2009)。

极化囊泡转移

T细胞微囊泡生物发生

细胞外囊泡通常被认为是通过从称为多泡体(MVBs)的特化晚期内吞室的界膜出芽和切割而产生(Babst 2011)。MVB界膜处的新生腔内囊泡(ILVs)是由ESCRT(转运所需的内体分选复合体)蛋白的晚期成员形成的(McCullough等人2013)，它们形成不同的大分子组装体，介导向外膜出芽和芽颈切断，导致约50 - 100 nm ILVs积累到MVB腔内。MVBs通过细胞内Ca2+依赖的机制胞出，导致其ILVs以细胞外囊泡的形式释放，通常称为外泌体(exosomes)。人们早就观察到T细胞释放细胞外囊泡(Blanchard et al. 2002, Esposito et al. 2014)，但导致这些囊泡形成和释放的机制仍在研究中。

对CD8+ T细胞的早期研究发现，在溶细胞颗粒中存在含TCR的膜性颗粒和典型的电子致密货物(Peters等，1989)。通过表面上的抗TCR抗体激活CD4+ T细胞导致释放含有αβTCR和TSG101的囊泡(Blanchard等，2002)。最近在抗原诱导的溶细胞颗粒内容物胞吐过程中观察到细胞毒性T细胞到APC的TCR极化释放和转移 (Ritter等，2015)。细胞溶解性T细胞的调节分泌途径(Holt et al. 2006)部分由Rab27和Munc 13-4控制，推测也参与了该途径释放的囊泡。

然而，T细胞来源的微泡的亚细胞起源一直难以确定，因为MVB起源的明确标志物尚未确定(Cocucci & Meldolesi 2015)。然而，对CD4+ T细胞系进行的更近期研究提示，含有四跨膜蛋白(CD63=LAMP3)(被认为是外泌体的标志物)的细胞外囊泡在免疫突触处释放，并通过抗原触发的胞吐作用转移到靶细胞(Mittelbrunn等，2011)。与细胞溶解颗粒中的细胞外囊泡一样，这些CD4+T来源的外泌体也含有TCR，但TCR的富集程度似乎不像四跨膜蛋白和其他标志物那么高。目前尚不清楚外泌体中包含的TCR是否在将囊泡靶向到携带相关pMHC(肽结合MHC)的细胞中发挥作用。我们最近在原代CD4+ T细胞中发现了细胞外囊泡生成的第二种途径;这一途径是通过识别APC上的同源pMHC而诱导的。这些细胞外囊泡起源于免疫突触的cSMAC，是由肌动蛋白介导的表面转运和TCR在突触中心积累的结果。这些失活的TCR被去磷酸化，被认为在cSMAC内化，在溶酶体中降解。令人惊讶的是，我们发现在cSMAC(由含有pMHC和ICAM-1的支撑平面双层形成)的>80%的TCR作为富含TCR的质膜来源的细胞外囊泡(外切体，ectosomes)从T细胞表面释放(Choudhuri et al. 2014)。毫不奇怪，这些T细胞细胞外囊泡也是由ESCRT依赖机制产生的(Choudhuri等人2014,Vardhana等人2010)。与这些外泌体中存在的高水平TCR相比，它们不富集典型的外泌体标志物，这反映了它们的细胞表面来源。突触细胞外囊泡有足够的TCR将自己固定在含有相关pMHC的表面，因此是抗原靶向。γδT细胞是否释放富含TCR的外切体尚不清楚，B细胞即使在双层膜上也没有证据显示释放含有表面免疫球蛋白的外切体。后者是不可能的，因为B细胞必须是专门收集抗原的。因此，我们要提醒，在未经过电子显微镜或其他高分辨率方法验证的情况下，不要将荧光显微镜下抗原受体阳性cSMAC的出现等同于细胞外囊泡释放(图3)。总之，最近的这些发现提示，抗原诱导的外泌体和外切体的产生和极化释放是细胞溶解性T细胞免疫突触和辅助性T细胞免疫突触中的常见过程。膜相关货物和细胞质货物被分选为外泌体和外泌体的多种可能性，加上不同的释放机制，表明其组成具有显著的多样性，这可能具有重要的功能。在解剖T细胞来源的外切体的生物发生和揭示突触外切体影响免疫功能的机制方面仍有许多工作要做。

细胞间通讯的细胞外囊泡

T细胞突触胞体中的胞外囊泡富含TCR，这是由于它们从cSMAC中释放，TCR在cSMAC中积累，并保持与位于APC表面的同源pMHC结合(Choudhuri et al. 2014)。因此，释放的富含TCR的外切体通过突触间隙转移到T细胞-B细胞突触处具有同源pMHC的B细胞。T细胞外切体与B细胞上同源的pMHC的结合启动了B细胞的早期信号传导，通过pMHC依赖的内吞作用使其内化。虽然确切的机制尚不清楚，但内化的T细胞外切体继续在B细胞中传递信号。T细胞外切体的跨突触转移和摄取提出了以下可能性:在T细胞脱离并继续寻找其他抗原提呈靶点后，它们很好地支持了来自内吞区室的B细胞信号传导。大量实验表明，在允许性细胞因子环境中，#多价 多价pMHC结合(交联)支持活化(抗原激发)B细胞的增殖和抗体产生(Andre等人1994,Lang等人2001,Monroe & Cambier 1983)。

外切体和外泌体上产生的TCR似乎与几十年来在活化T细胞上清液中观察到的可溶性TCR相符。值得注意的是，含TCR的上清液足以诱导具有同源pMHC抗原的被启动B细胞分泌抗体(Guy et al. 1989)。TCR从细胞表面切除和释放的机制尚不清楚，这增加了在培养上清中释放的TCR存在于细胞外囊泡的可能性。TCR富集的外切体是否在动员抗原特异性B细胞效应功能方面提供长期帮助需要进一步研究。T细胞外泌体转移到B细胞可能是APC长期信号整合的关键，而APC在体内被辅助性CD4+ T细胞访问了数小时。

T细胞外切体和外泌体在免疫突触的跨突触摄取在受体细胞中可能具有非冗余的功能。在人CD4+ T细胞系中，释放的外泌体含有微小RNA (miRNA)，包括miR-335，这些miRNA在超抗原诱导的接合后改变受体Raji B细胞系中的基因表达模式(Mittelbrunn等人2011)。虽然这些发现尚未在主要抗原特异性人T细胞-B细胞相互作用中得到证实，但它们为我们提供了一个有趣的视角，使我们得以瞥见转运的miRNA介导的细胞外囊泡免疫调节领域。这种外泌体转移在机制上不同于外切体转移，因为鞘磷脂酶处理Jurkat T细胞或敲低肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hrs)(参与早期作用ESCRT复合物)可阻断前一过程，而这两种方法均不会损害原代CD4+ T细胞的突触外切体释放。有趣的是，最近的一项研究报告，小鼠Foxp3+ T调节性细胞(Treg)参与了能够调节Th1效应细胞的外泌体的非定向释放，而Th1效应细胞在病毒和细胞内细菌感染的情况下产生IFN-γ (Okoye等，2014)。Treg来源的外泌体对Th1细胞增殖和细胞因子分泌的抑制涉及miRNA向Th1细胞的转移，这增加了外泌体参与旁分泌抑制的可能性(O 'Hara 1995)。因此，细胞外囊泡，如细胞因子(Huse等，2006)，要么似乎通过突触发挥作用，从而实现更强的特异性，要么可以以非定向方式释放，从而与周围的许多细胞进行旁分泌交流。由于外切体与pMHC预先相关，它们兴许不太可能逃逸突触。T细胞外切体可能通过表面受体相互作用诱导信号传导，调节受体细胞的功能。这些外切体是否含有可能有助于免疫细胞调节的miRNA或其他货物还需要进一步研究。

艾滋病毒传播

嗜T细胞性人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)使用三聚体包膜蛋白gp120靶向T细胞表面受体CD4、CXCR4和CCR5，从而进入CD4+细胞，在那里它们能够复制并整合到T细胞基因组中(Berger等，1999)。在受感染的T细胞中产生病毒蛋白质和RNA后，病毒成分运输到质膜，在质膜中，ESCRT机制(特别是TSG101和ALIX)被利用来出芽和释放病毒颗粒(von Schwedler等，2003)。由于细胞表面的新生病毒和无细胞病毒颗粒特别容易受到中和宿主抗体的影响，因此HIV-1进化出了复杂的机制，以避免在宿主体内传播和传播过程中暴露于宿主免疫。HIV-1使用的一个关键策略是劫持免疫突触的成分，与未感染的细胞形成病毒学突触(VS) (Piguet & Sattentau 2004)。VS将新生病毒颗粒隔离在紧密相连的细胞-细胞连接内，有效地保护释放的病毒体免受宿主抗体的影响。因此，接触依赖性细胞间病毒传播的效率高达无细胞感染的1,000倍，是继发性淋巴组织内病毒传播的主要方式。

在经典的HIV介导的T细胞病毒学突触中，HIV感染的T细胞表面组装的gp120启动了试探性细胞-细胞接触。这种作用导致CD4在反式中与未感染的CD4+ T细胞、树突状细胞和巨噬细胞的结合。LFA-1与靶细胞上的ICAM-1结合，初步接触被LFA-1巩固为黏附连接(VasiliverShamis et al. 2010)。整合素介导的黏附和信号传导将MTOC招募到VS，从而指导细胞骨架极化(特别是f-肌动蛋白重构)和病毒成分定向转运到VS，从而形成psMAC样黏附环和中央组织病毒蛋白。虽然TCR不参与靶细胞，但gp120与CD4的结合似乎可诱导TCR近端信号减弱(包括TCR-ζ、Lck、ZAP-70、LAT和PLC-γ的磷酸化)，但未观察到细胞内Ca2+升高(vasilive - shamis等人2009)。HIV结构多聚蛋白Gag通过侧向表面运输和附近细胞内储存的主动运输募集到VS。最近的报告还表明，新生的HIV Env蛋白利用T细胞的调节分泌途径(Jolly等。2011)。然而，微管介导的转运在HIV传播中的作用仍然存在争议，因为几项研究发现微管解聚没有影响。Gag被募集到T细胞的质膜上，并在离散的点状中组装成膜下晶格。Gag招募TSG101和ALIX，以及随后ESCRT III和VPS4复合体的成员，以促进向外出芽和从质膜脱落(Baumgartel et al. 2011, Jouvenet et al. 2011)。ESCRT介导的HIV从T细胞表面出芽的机制与免疫突触释放富含TCR的外泌体非常相似，这表明HIV利用宿主细胞反应来进行病毒传播的可能性。

前景

在上面，我们回顾了在免疫反应过程中，从亚细胞细胞器动力学到淋巴结组织尺度的过程，涉及TCR触发的亚微米分子组装的细胞极化和T细胞免疫突触的最新研究进展。我们的综述首先讨论了适应性免疫的进化背景，以及主要适应性免疫细胞类型如何在适应性免疫进化之前作为载体出现，这提示存在与这些发育谱系相关的高度保守行为。这些领域仍然是完全开放的研究，因为还没有对来自agnathans的适应性淋巴细胞或大多数颌口固有淋巴细胞的相互作用进行过细胞生物学研究，除了研究相对充分的自然杀伤细胞。在分离和培养足够数量的这些细胞方面取得的进展，加上创新的单细胞成像方法(可减少定量成像所需的细胞数量)，将使我们能够对这些悬而未决的问题进行更深入的探索。利用包括slb在内的免疫突触工具，可以更好地了解诱导触发所需的γδTCR配体的组织变化。对于传统的辅助性T细胞和细胞毒性T细胞，启动信号传导的基本机制尚未完全确定，有待研究。随着外泌体在Treg细胞功能中的研究进展，细胞外囊泡的生理作用越来越清晰。靶向不同来源的细胞外囊泡的遗传学或药理学方法对于确定体内功能至关重要。光学和电子显微镜技术的进步将使我们能够更好地了解T细胞和其他免疫细胞如何利用极性和复杂的三维结构(如免疫突触)来发动有效的免疫反应。