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文献中越来越多的证据表明，使用医用三氧作为新冠肺炎患者可能的替代和辅助治疗的可行性，显著缩短了住院时间、促炎指标和凝血指标，并改善了血氧参数。除了医用三氧通过上调主要抗氧化剂和清除酶对抗氧化应激的明确能力外，氧气-三氧（O2-O3）治疗还被证明可以有效减少慢性炎症和免疫血栓的发生，这两个关键因素参与了新冠肺炎的加重和严重程度。由于慢性炎症和氧化应激也被报道为SARS-CoV2感染长期后遗症的主要驱动因素，越来越多的研究正在调查O2–O3治疗减少和/或预防广泛的COVID后（或PASC）相关疾病的潜力。三氧作用的分子机制，作为替代性和辅助性新冠肺炎治疗的临床证据是人们所关心的问题。 三氧是由三个氧原子组成的氧的同素异形体，这个奇怪的名字源于希腊语ὄζειν（气味），1840年由克里斯蒂安·弗里德里希·施恩宾（Christian Friedrich Schönbein）发现。根据微波光谱学的实验证据，臭氧是一种三原子分子，与水分子具有相似的对称性。键距为127.2×10−12 m，而O-O-O角为116.78°，使其成为极性分子。 Ivanov, S.V.; Panchenko, V.Y. Infrared and microwave spectroscopy of ozone: Historical aspects. Phys. -Uspekhi 1994, 37, 677–695. 作为一种氧的同素异形体，三氧被描述为一种“超级氧”或“活性氧”，但令人惊讶的是，当用于医学治疗时，它在细胞氧化应激的复杂反应中起主导作用。尽管三氧是一种“超级氧气”，但在医学治疗中，它并不是一种超级氧化剂，而是一种抗氧化剂。三氧的这一自相矛盾的特征不能简单地来自其化学性质，相反，它能够与信号通路和细胞器周转的生化机制内的高度复杂、相互关联和混沌系统相互作用，这是细胞核心生命的特征。 活性氧（ROS）是众所周知的有害物质，即，它们会对大分子造成化学损伤但也是不太为人所知的信号分子，尽管有人提出了有争议的意见，因为ROS是细胞内的毒性产物。细胞生命的基本原则是，在生物体中广泛存在的非常常见的分子也被用作调节和调节生物分子。 因此，ROS无论是在一些具有有害后果的病理中，还是在具有年轻化结果的组织重塑中。但在细胞生理钟用作信号传导的基本元件。 ROS应作为信号分子的主要作用部位是线粒体和内质网复合体（ER）或最近描述的“线粒体相关内质网膜”或MAMs，MAM调节细胞生命的基本项目，包括其生存和应激反应，调节钙运输和脂质合成、线粒体生物发生和动力学、自噬和凋亡以及炎症小体的活性，因此，MAM的完整性对细胞至关重要。 关于新冠肺炎，三氧如何在这个系统中发挥作用？ 一种可能性（尽管目前尚不确定），臭氧可能会靶向人类肺上皮细胞中的氯离子通道，并激活Nrf2/Keap1/ARE系统，以缓冲臭氧靶向氯离子通道受损、过度改变可能造成的损害。 Canella, R.; Martini, M.; Borriello, R.; Cavicchio, C.; Muresan, X.M.; Benedusi, M.; Cervellati, F.; Valacchi, G. Modulation of Chloride Currents in Human Lung Epithelial Cells Exposed to Exogenous Oxidative Stress. J. Cell. Physiol. 2017, 232, 1817–1825. [Google Scholar] [CrossRef] Canella, R.; Benedusi, M.; Martini, M.; Cervellati, F.; Cavicchio, C.; Valacchi, G. Role of Nrf2 in preventing oxidative stress induced chloride current alteration in human lung cells. J. Cell. Physiol. 2017, 233, 6018–6027. [Google Scholar] [CrossRef] 氯离子通道调节的激活应在MAM水平上抑制NLRP3炎症小体的K+外排依赖性激活。如果得到证实，这一机制应该涉及臭氧最终抗炎作用中这些参与者的精细调节。 Swanton, T.; Beswick, J.A.; Hammadi, H.; Morris, L.; Williams, D.; de Cesco, S.; El-Sharkawy, L.; Yu, S.; Green, J.; Davis, J.B.; et al. Selective inhibition of the K+ efflux sensitive NLRP3 pathway by Cl− channel modulation. Chem. Sci. 2020, 11, 11720–11728 但臭氧可能在多个层面上起作用。 我们知道，炎症小体NLRP3在单核细胞和巨噬细胞中被SARS-CoV2激活 Kaivola, J.; Nyman, T.A.; Matikainen, S. Inflammasomes and SARS-CoV-2 Infection. Viruses 2021, 13, 2513 这一情况应与SARS-CoV1导致线粒体功能失调损害的能力及其线粒体吞噬机制有关。 Shang, C.; Liu, Z.; Zhu, Y.; Lu, J.; Ge, C.; Zhang, C.; Li, N.; Jin, N.; Li, Y.; Tian, M.; et al. SARS-CoV-2 Causes Mitochondrial Dysfunction and Mitophagy Impairment. Front. Microbiol. 2022, 12, 780768 因此，由于Nrf2和炎症小体之间的相互作用，有可能调节线粒体相关的NLRP3以激活Nrf2途径 Hennig, P.; Garstkiewicz, M.; Grossi, S.; Di Filippo, M.; French, L.E.; Beer, H.-D. The Crosstalk between Nrf2 and Inflammasomes. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 562. 可以通过精细调节的三氧治疗进行处理。 科学研究排除了直接从大气三氧中产生有益三氧的可能性，因为最近观察到，生活在近海环境中的人，特别是三氧含量高、发动机粉尘污染物含量低，受SARS-CoV2感染的程度低于生活在大陆和城市人口密集地区的人群。 Chirumbolo, S.; Bjørklund, G. The bimodal SARS-CoV-2 outbreak in Italy as an effect of environmental and allergic causes. J. Allergy Clin. Immunol. 2020, 146, 331–332. 可能，三氧的抗炎作用，通过该分子的直接作用，主要由原位先天免疫细胞发挥。 Kettle, A.J.; Winterbourn, C.C. Do neutrophils produce ozone? An appraisal of current evidence. BioFactors 2005, 24, 41–45.Babior, B.M.; Takeuchi, C.; Ruedi, J.; Gutierrez, A.; Wentworth, P. Investigating antibody-catalyzed ozone generation by human neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 3031–3034. 医用三氧的抗氧化和抗炎活性，即气态三氧（通常在平衡的氧气-三氧混合物中），经常作为三氧血液注射或作为三氧油注射，依赖于相对低剂量的三臭氧通过ROS信号激活细胞应激反应的能力。这在机体内被称为“兴奋”，与线粒体有关，又称线粒体兴奋，通常被认为是生存过程和抗衰老的因素。 三氧实际上不会直接引发促炎反应，以帮助先天免疫细胞清除病毒。 线粒体调节核苷酸结合寡聚结构域样受体家族的激活，即含嘧啶结构域-3（NLRP3）炎症小体 在应激或细胞微生物感染时，线粒体启动NLRP3平台的激活，导致caspase-1介导的促炎细胞因子IL-1β和IL-18的产生。 Liu, Q.; Zhang, D.; Hu, D.; Zhou, X.; Zhou, Y. The role of mitochondria in NLRP3 inflammasome activation. Mol. Immunol. 2018, 103, 115–124. 线粒体兴奋是一种调节机制，已知具有抗氧化特性的特定分子，如MitoQ、SkQ1、Szeto Schiller 31肽，能够在压力输入后调节线粒体功能障碍 Patergnani, S.; Bouhamida, E.; Leo, S.; Pinton, P.; Rimessi, A. Mitochondrial Oxidative Stress and “Mito-Inflammation”: Actors in the Diseases. Biomedicines 2021, 9, 216. 因此三氧应该能够通过促分裂作用，精准调节线粒体管理ROS介导的信号系统的能力。 一些基本蛋白参与ROS作为信号分子而非有害氧化和反应物质（兴奋）的机制，其中最受研究的是硫氧还蛋白-2（Trx2） 这是一种具有氧化还原性质和双Cys氧化还原反应位点的小蛋白（C90和C93）。Trx2的作用是通过以可逆的方式氧化Cys二硫键来维持细胞的还原状态，在这个意义上，它通过凋亡相关调节激酶1（ASK-1）和核因子κB（NF-κB）调节基本途径。 Chen, Y.; Zhou, Z.; Min, W. Mitochondria, Oxidative Stress and Innate Immunity. Front. Physiol. 2018, 9, 1487. 血液中三氧释放介质激活Nrf2、Trx和谷胱甘肽（GSH/GSSG）系统，从而通过Trx2耗竭导致的半胱天冬酶3和9抑制凋亡信号，并减弱TNF介导的线粒体ROS（mtROS）升高 线粒体介导的炎症反应的激活，通过有丝分裂兴奋机制对抗SARS-CoV2，使线粒体免受有丝分裂吞噬和功能障碍的影响，而这种机制只能通过促氧化剂分子（如臭氧及其中间体）在有丝分裂刺激剂量下的活性来维持。 新冠肺炎的发病机制可能是由微循环内皮功能受损引起的。最重要的是阐明NO在内皮生理学和内皮血小板免疫相互作用中的作用，特别是在SARS-CoV2感染方面。 Bonaventura, A.; Vecchié, A.; Dagna, L.; Martinod, K.; Dixon, D.L.; Van Tassell, B.W.; Dentali, F.; Montecucco, F.; Massberg, S.; Levi, M.; et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 319–329 线粒体维持其混沌动力学（在分裂和融合之间振荡）的能力受到一氧化氮（NO）的高度调节，因为低浓度的NO会诱导线粒体生物发生。该机制通过激活cGMP介导的途径介导，与PGC-1α、Tfam和Nrf-1的表达增强相关激活线粒体融合。 Infantes, E.C.; Bautista, J.T.; Beltrán-Povea, A.; Cahuana, G.M.; Soria, B.; Nabil, H.; Bedoya, F.; Tejedo, J.R. Regulation of mitochondrial function and endoplasmic reticulum stress by nitric oxide in pluripotent stem cells. World J. Stem Cells 2017, 9, 26–36 ROS的适度或轻微激活可能是触发NO作为细胞器间介质的关键，如线粒体和内质网（ER）通讯。 Nisoli, E.; Falcone, S.; Tonello, C.; Cozzi, V.; Palomba, L.; Fiorani, M.; Pisconti, A.; Brunelli, S.; Cardile, A.; Francolini, M.; et al. Mitochondrial biogenesis by NO yields functionally active mitochondria in mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 16507–16512 因此，内皮一氧化氮合酶（eNOS）是NO诱导线粒体生物发生的主要启动子；来自先天免疫细胞的内皮细胞和线粒体之间的交叉相关相互作用可能是臭氧及其介质的促分裂活性作为SARS-CoV2发病机制抑制剂的主要生化途径。 所有这些LOP介导三氧的活性，从一种直接的有毒化合物到一种引起兴奋的药物。通过调整医用氧气-三氧混合物中三氧剂量范围，使三氧有可能对新冠肺炎的治疗产生有益作用。 RAW 264.7巨噬细胞系的实验表明，低剂量4-HNE（0–100μM，即0–15.6μg/mL 4-HNE）降低了这些细胞的PMA炎症激活，而高剂量LOP（200–300μM，约30–45μg/mL 4-HNE）增加了PMA的有害影响。 Harry, R.S.; Hiatt, L.A.; Kimmel, D.W.; Carney, C.K.; Halfpenny, K.C.; Cliffel, D.E.; Wright, D.W. Metabolic Impact of 4-Hydroxynonenal on Macrophage-Like RAW 264.7 Function and Activation. Chem. Res. Toxicol. 2012, 25, 1643–1651. 我们要确定医用三氧浓度（即30–85μg/m]）是否应引起4-HNE或其他相关LOP的兴奋浓度 我们知道三氧与血浆中的氧的溶解度大约是水的10倍。 Bocci, V.A.; Zanardi, I.; Travagli, V. Ozone acting on human blood yields a hormetic dose-response relationship. J. Transl. Med. 2011, 9, 66. 如果使用通常的医用三氧浓度，例如40μg/mL（≈0.84μg/mL），在三氧活性的前5分钟内，至少78%的氨基酸可能被氧化，形成脱氢L-抗坏血酸，20%的尿酸可能被氧化成尿囊素 Shinriki, N.; Suzuki, T.; Takama, K.; Fukunaga, K.; Ohgiya, S.; Kubota, K.; Miura, T. Susceptibilities of Plasma Antioxi-dants and Erythrocyte Constituents to Low Levels of Ozone. Haematologia (Budap) 1998, 29, 229–239 只有10%的α-生育酚可能被氧化为α-生育球基。因此，非常少量的臭氧应与生成LOP的脂质反应，即约0.5–1.0%（即31–62 nM 4-HNE），因此在兴奋范围内。 Bocci, V.A.; Zanardi, I.; Travagli, V. Ozone acting on human blood yields a hormetic dose-response relationship. J. Transl. Med. 2011, 9, 66. 在一项使用RAW 264.7巨噬细胞的体外研究中，用1至100 nM 4-HNE处理细胞24小时后，亚硝酸盐水平保持在12–13μmol/L左右。分子4-HNE通过调节作用于iNOS表达并依赖于Nrf2的正确NO量，导致天然免疫细胞（如巨噬细胞）中NO和Nrf2之间的迂回相互作用。 Gatbonton-Schwager, T.N.; Sadhukhan, S.; Zhang, G.-F.; Letterio, J.J.; Tochtrop, G.P. Identification of a negative feedback loop in biological oxidant formation fegulated by 4-hydroxy-2-(E)-nonenal. Redox Biol. 2014, 2, 755–763. 总之，4-HNE在对抗SARS-CoV2的治疗斗争中的作用可以概括为触发Nrf2和NO在对抗病毒进入的促炎反应中的相互作用的机制，同时通过NO/eNOS系统调节内皮的作用。该机制应阐明4-HNE和其他LOP如何能够引发SARS-CoV2的促炎反应，而不会产生内皮损伤、血栓栓塞、免疫紊乱或患者病情恶化的氧化应激反应。 Cenci, A.; Macchia, I.; La Sorsa, V.; Sbarigia, C.; Di Donna, V.; Pietraforte, D. Mechanisms of Action of Ozone Therapy in Emerging Viral Diseases: Immunomodulatory Effects and Therapeutic Advantages with Reference to SARS-CoV-2. Front. Microbiol. 2022, 13, 871645. 在循环血液中，医用三氧还产生血红素加氧酶1（HO-1），它是最佳线粒体功能的基本调节器 Bocci, V.; Aldinucci, C.; Mosci, F.; Carraro, F.; Valacchi, G. Ozonation of Human Blood Induces a Remarkable Upregulation of Heme Oxygenase-1 and Heat Stress Protein-70. Mediat. Inflamm. 2007, 2007, 26785. Hull, T.D.; Boddu, R.; Guo, L.; Tisher, C.C.; Traylor, A.M.; Patel, B.; Joseph, R.; Prabhu, S.D.; Suliman, H.B.; Piantadosi, C.A.; et al. Heme oxygenase-1 regulates mitochondrial quality control in the heart. JCI Insight 2016, 1, e85817. 当线粒体功能受损时，这种功能会产生缺氧，以保护线粒体存活。然而，缺氧可能是新冠肺炎严重进展为ARDS的基本因素。 Korski, K.I.; Kubli, D.A.; Wang, B.J.; Khalafalla, F.G.; Monsanto, M.M.; Firouzi, F.; Echeagaray, O.H.; Kim, T.; Adamson, R.M.; Dembitsky, W.P.; et al. Hypoxia Prevents Mitochondrial Dysfunction and Senescence in Human c-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Stem. Cells 2019, 37, 555–567. Grieb, P.; Swiatkiewicz, M.; Prus, K.; Rejdak, K. Hypoxia may be a determinative factor in COVID-19 progression. Curr. Res. Pharmacol. Drug Discov. 2021, 2, 100030. 在缺氧条件下，巨噬细胞HO-1转移到线粒体中，在那里它应该激活ROS产生和自噬标记物LC3和Drp-1。 Bansal, S.; Biswas, G.; Avadhani, N.G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2013, 2, 273–283 然而，低剂量的HO-1诱导线粒体兴奋，会产生一个涉及ROS（H2O2）、Nrf2和HIF-1α的短自动回路，这是HO-1的一种诱导形式。 Shen, H.-H.; Wang, C.-J.; Zhang, X.-Y.; Sheng, Y.-R.; Yang, S.-L.; Zheng, Z.-M.; Shi, J.-L.; Qiu, X.-M.; Xie, F.; Li, M.-Q. HIF1A-induced heme oxygenase 1 promotes the survival of decidual stromal cells against excess heme-mediated oxidative stress. Reproduction 2022, 163, 33–43. 从而有助于在缺氧微环境中精细调节线粒体稳定性。HIF-1α的控制由NO介导，NO反过来被谷胱甘肽和过氧亚硝酸盐清除剂的活性抵消，因此机体NO-HIF-1α-HO-1-Nrf2通过线粒体稳定性调节缺氧对细胞生存能力的影响。 Agani, F.H.; Puchowicz, M.; Chavez, J.C.; Pichiule, P.; LaManna, J. Role of nitric oxide in the regulation of HIF-1α expression during hypoxia. Am. J. Physiol. Physiol. 2002, 283, C178–C186.三氧的兴奋活性可能仅限于这样一个假设，即它促进线粒体稳态，试图减少那些导致氧化应激阈值的途径，其中ROS激活一系列导致炎症、自噬和/或凋亡的机制。三氧对缺氧的活性首先是红细胞。 HIF-1α在SARS-CoV2感染的进展中起着至关重要的作用，在上述氧化应激反应被克服的情况下，与持续炎症反应相关，应导致新冠肺炎加重，然而，HO-1能够通过下游和上游方式调节HIF-1α，从而降低缺氧导致的缺血风险。 在这些情况下，由于HIF-1α在危重症条件下被HO-1稳定，如果HIF-1α通过诱导丙酮酸脱氢酶激酶1的表达使线粒体与氧化呼吸解偶联并诱导糖酵解途径，则氧的作用可能无效。 Dunn, L.L.; Kong, S.M.; Tumanov, S.; Chen, W.; Cantley, J.; Ayer, A.; Maghzal, G.J.; Midwinter, R.G.; Chan, K.H.; Ng, M.K.; et al. Hmox1 (Heme Oxygenase-1) Protects Against Ischemia-Mediated Injury via Stabilization of HIF-1α (Hypoxia-Inducible Factor-1α). Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2020, 41, 317–330. HIF-1α的兴奋活性可能是在常氧状态下获得的，因为HIF-1α是由氧化应激反应超阈值水平引起的特定元素触发的，包括凝血酶和激活二酰甘油敏感的PKC以及NF-κB，包括ROS，当激活PI3K/p70S6K途径并包括HIF-1α的Tyr激酶受体处的反式激活时。在这些情况下，HIF-1α的稳定可能恶化新冠肺炎的发病机制。 通常由血管紧张素II诱导的HIF-1α稳定的常压控制显示出与缺氧条件下HIF-1β稳定的机制非常相似的机制，其中H2O2有助于降低L-抗坏血酸（维生素C）的水平，这种情况可能表明维生素C在减少新冠肺炎恶化方面发挥作用，但其机制非常复杂。 Pagé, E.L.; Chan, D.A.; Giaccia, A.J.; Levine, M.; Richard, D.E. Hypoxia-inducible Factor-1α Stabilization in Nonhypoxic Conditions: Role of Oxidation and Intracellular Ascorbate Depletion. Mol. Biol. Cell 2008, 19, 86–94. 三氧及其脂质过氧化物介体的抗病毒活性应与非常精细和复杂的自动调节机制有关，这涉及Nrf2和NF-κB之间的平衡。 Yousefi, B.; Banihashemian, S.Z.; Feyzabadi, Z.K.; Hasanpour, S.; Kokhaei, P.; Abdolshahi, A.; Emadi, A.; Eslami, M. Potential Therapeutic Effect of Oxygen-Ozone in Controlling of COVID-19 Disease. Med. Gas. Res. 2022, 12, 33–40. 臭氧治疗SARS-CoV2的关键机制：炎症、AhRs和一氧化氮
随着NF-kB表达的增加，建立了以促炎细胞因子和抗炎分子之间失衡为特征的慢性炎症状况。同时，NF-kB介导的信号传导触发iNOS和COX的表达，进而促进ROS和RNS的积累。慢性炎症和氧化应激都会导致免疫血栓形成，这与新冠肺炎的严重程度相关。医用臭氧既可以作为抗炎分子（通过H2O2介导的NF-kB抑制），也可以作为抗氧化剂（通过4-HNE-Nrf2介导的各种抗氧化效应物的转录）。最后，臭氧诱导的HO-1升高抵消了免疫血栓的形成。 在氧化还原稳态中，一系列分子参与复杂的ROS信号介导的应激反应。例如，P450细胞色素CYP1B1是调节氧化还原稳态的关键因素。 Falero-Perez, J.; Song, Y.-S.; Sorenson, C.M.; Sheibani, N. CYP1B1: A key regulator of redox homeostasis. Trends Cell Mol. Biol. 2018, 13, 27–45. 在高氧条件下，如发生在新冠肺炎中的CY1B1，其生成被TNF-α增强，通过在DNA中形成氧化加合物来缓冲活性氧；因此，新冠肺炎是一种由于TNF-α而使CYP1B1作为ROS信号分子的关键调节因子的作用受损的疾病。三氧可以通过芳基烃受体（AhRs）被细胞“感知”，AhRs下游信号激活CYP1B1。 最近的证据表明，4-HNE的活性与AhRs的相关上调相关。AhR的作用比预期的要有趣得多。AhR是一种暴露体配体，即一种转录因子，调节植物来源的多酚类物质、化学毒物和外源性物质、内源性副产物和微生物组分解代谢物的多种作用。 Larigot, L.; Benoit, L.; Koual, M.; Tomkiewicz, C.; Barouki, R.; Coumoul, X. Aryl Hydrocarbon Receptor and Its Diverse Ligands and Functions: An Exposome Receptor. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2022, 62, 383–404 从根本上讲，它是一种排毒因子。如果臭氧衍生的臭氧化合物，如4-HNE、4-HHE和PUFA衍生的LOPs，靶向AhR，则线粒体外膜20的易位酶（TOOM20）将AhR导入线粒体。LOPs激活AhRs和4-HNE，最可能的是ROS的轻微诱导增强了AhRs的快速和显著表达，从而使细胞准备调整线粒体介导的应激反应，例如，引发NLRP3介导的反应。 三氧能够治疗新冠肺炎的方式涉及广泛的生物分子制剂和信号途径。在兴奋性AhR介导的途径中，NLRP3炎症小体的激活启动了促炎、抗病毒过程，被巨噬细胞释放的一氧化氮（NO）关闭，进而以剂量依赖的方式抑制SARS-CoV2的复制和生命周期。 总之，臭氧的多功能性确保了O2–O3治疗降低和减少PASC的不同症状，尽管有积极的初步结果，仍需要更多的证据来评估PASC中O2–O3治疗的可行性、安全性和有效性。 医用混合物中的臭氧（通常用作自体血液疗法、直肠充气或臭氧盐水）对抗SARS-CoV2感染进展的能力在于臭氧触发脂质过氧化物生成的能力，能够促进对氧化应激的促分裂反应。 臭氧能够引发多少基本途径和生化层间相互作用，以激活对氧化应激的兴奋反应，其中维持线粒体稳定性和最佳功能的精细稳态至关重要。 臭氧能够激活细胞抵抗病毒感染和新冠肺炎病理学的能力。 |
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