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 癫痫是一种反复发作的慢性神经系统疾病之一，这种疾病特点是大脑中的神经元过度或超同步放电而发生两次或更多无预兆、无诱因的发作。许多脑部核团和各种各样的神经递质参与了癫痫发作的病理过程。GABA-A受体是由抑制性神经递质GABA激活的一种五聚体配体门控氯离子通道，是许多癫痫药物的主要靶标。尽管抗癫痫药物可以对癫痫发作进行对症控制，但癫痫仍然无法治愈，部分原因是我们对癫痫发展的分子和电生理基础了解不足。通过实验的方法建立各种实验动物癫痫模型将有助于我们对癫痫病理的深入理解，对于发现癫痫和相关脑部疾病的有效治疗方法至关重要。 目前使用化学致痫剂建模来研究癫痫在现在的癫痫研究和新的抗癫痫药物(AEDs）的筛选中是最为广泛使用的方法。不同化学药物诱导的癫痫模拟临床不同的癫痫类型，戊四唑（Pentetrazol，PTZ）、海人藻酸（Kainic，KA）和匹罗卡品（Pilocarpine，Pilo）是目前最常用的几种癫痫模型的化学药物。 戊四唑，原为一种强心剂，是最为广泛使用的系统注射致癫痫剂。为中枢神经系统和呼吸兴奋剂，非竞争性GABA-A受体拮抗剂，主要作用于GABA受体TBSP位点。PTZ导致的阵挛癫痫发作常用来进行筛选抗惊厥药物的测试。通常PTZ使用皮下或腹腔注射的方法来建立模型。腹腔反复注射低剂量PTZ可以导致含有癫痫持续状态的化学点燃模型。 海人藻酸是1953年由日本科学家从肠道驱虫剂海洋藻类“Kainin-sou”(海人草)提取得到的一种酸性物质。KA是最常使用的神经毒剂，能够模拟谷氨酸效应与促离子型谷氨酸受体KA受体相结合，因此其具有强烈的中枢神经系统兴奋作用和致痫作用。KA能够在海马和杏仁核导致反复性癫痫发作和神经元损伤。KA导致的在潜伏期后的慢性癫痫状态和紧接其后的癫痫持续状态已在研究中被广泛使用。 匹罗卡品（毛果芸香碱) 诱导癫痫的能力可能取决于 M1 受体的激活，并可在癫痫发作后可引起海马谷氨酸水平升高及 NMDA 受体激活，从而维持癫痫发作。 该模型具有反复自发性发作、典型海马硬化、苔藓纤维发芽等特点。匹罗卡品模型相较于上述药物发作更加持久，更可靠、实验时间更短及成本最低。虽然其脑电图特征和神经病理学改变与 KA 相似，但全身应用匹罗卡品后，可观察到丘脑、黑质、大脑皮质等更广泛的形态学病变。 此外，锂-毛果芸香碱模型不仅可减少匹罗卡品剂量，也显示出与人类持续性癫痫非常相似的表现，杏仁核电刺激代替锂预处理也可得到类似效果。 戊四唑PTZ、海人藻酸KA、匹罗卡品（毛果芸香碱)、甲基东莨菪碱、0.9% 生理盐水、DMSO、吐温-80 1ml注射器若干、小鼠透明观察箱10个、计时器、时间记录纸 C57BL/6J 小鼠 （一）戊四唑癫痫模型1.配制65 mg/kg PTZ 溶液，0.9% 生理盐水。 2.将小鼠称重编号，随机分组，每组十只，分别放入十个铺好垫料的小鼠透明观察箱适应半小时。 3.对照组小鼠按照0.1ml/10g的给药体积腹腔注射生理盐水后开始计时，观察2h，并记录现象。观察结束后脱颈处死。 4.造模组小鼠按照0.1ml/10g的给药体积腹腔注射65mg/kg PTZ后开始计时，观察2h，记录阵发性惊厥潜伏期、强直性痉挛潜伏期，以及Ⅲ~Ⅴ级癫痫发生次数。观察结束后脱颈处死。 （二）海人藻酸癫痫模型1.配制30 mg/kg KA 溶液，0.9% 生理盐水。 2.将小鼠称重编号，随机分组，每组十只，分别放入十个铺好垫料的小鼠透明观察箱适应半小时。 3.对照组小鼠按照0.1ml/10g的给药体积腹腔注射生理盐水后开始计时，观察2h，并记录现象。观察结束后脱颈处死。 4.造模组小鼠按照0.1ml/10g的给药体积腹腔注射30mg/kg KA后开始计时，观察2h，记录阵发性惊厥潜伏期、强直性痉挛潜伏期，以及 Ⅲ~Ⅴ 级癫痫发生次数。观察结束后脱颈处死。 （三）匹罗卡品癫痫模型1.配制1mg/kg 甲基东莨菪碱溶液，200mg/kg 和50mg/kg 匹罗卡品溶液，10mg/kg DZP，0.9% 生理盐水。 2.将小鼠称重编号，随机分组，每组十只，分别放入十个铺好垫料的小鼠透明观察箱适应半小时。 3.对照组小鼠按照0.1ml/10g的给药体积腹腔注射生理盐水后开始计时，观察2h，并记录现象。观察结束后脱颈处死。 4.造模组小鼠按照0.1ml/10g的给药体积，首先腹腔注射1mg/kg 甲基东莨菪碱，10min后注射200mg/kg 匹罗卡品，之后每隔15min注射一次50mg/kg 匹罗卡品直至出现癫痫持续发作SE，观察2h，记录阵发性惊厥潜伏期、强直性痉挛潜伏期，以及 Ⅲ~Ⅴ 级癫痫发生次数。观察结束后脱颈处死或用10mg/kg DZP终止癫痫发作。 1.根据Racine分级法将小鼠癫痫发作程度分为不同等级： ① 0级无任何反应； ②Ⅰ级面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等； ③Ⅱ级：Ⅰ级加节律性点头； ④Ⅲ级：Ⅱ级加前肢肌阵挛，但无后肢直立位； ⑤Ⅳ级：Ⅲ级加后肢直立位； ⑥Ⅴ级：全面性强直-阵挛发作，并失去体位控制。 2.阵发性痉挛潜伏期：是指从给药开始计时到第一次癫痫小发作（1~Ⅲ级）的间隔时间，可以反映癫痫模型对于阵发性痉挛的诱发特点。 3.强直性痉挛潜伏期：是指从给药开始计时到第一次癫痫大发作（Ⅴ级）的间隔时间，可以反映癫痫模型对于强直性痉挛的诱发特点。强直性痉挛潜伏期越短，发作次数越多，表明癫痫发作越严重。 4.Ⅲ~Ⅴ级癫痫发生次数：记录不同等级癫痫发作次数可以用于计算2h内癫痫发作总次数及平均发作等级，可以反映药物诱发癫痫状态的特点及严重程度。 可通过GraphPad Prism 9对各项指标进行作图，与对照组进行对比可使用非配对T检验，同时可增加不同剂量待测抗癫痫药物治疗组用以比较抗癫痫药物是否具有显著缓解癫痫发作的效果。 1.测试时长可根据实验需求自行调整。 2.本文介绍的实验方法均为急性癫痫造模，不可重复测试。 3.文献报道多采用C57BL/6J 小鼠或SD大鼠，SD大鼠造模方法与小鼠有出入，需重新调研文献确认方案。 4.溶液要现配现用，防止分解变质。 5.小鼠实验前先放到实验环境适应一天，防止应激反应。 6.每组测试完要更换垫料，并清洁透明箱，防止留下上一组小鼠的气味，影响实验结果。 7.实验前注射甲基东莨菪碱是为了防止匹罗卡品出现的胆碱能周围神经刺激症状, 即竖毛、流涎、血泪症, 或不同程度的少动、盯视、嘴部自动症、点头、眨眼、湿狗样晃动。 8.一次性腹腔注射大剂量匹罗卡品易导致实验动物死亡率过高，因此应分次小剂量给药诱发癫痫持续状态。 PTZ造模方法潜伏期极短，癫痫发作等级非常高，死亡率也较高。一般在注射戊四氮后的 5min 内，小鼠即出现躯体游走性痉挛、臀部上翘等表现， 随后出现睑肌阵挛、凝视、点头运动、尾巴上翘，继而双前肢抬起阵挛或后肢伸展、头向左或右扭动，随后出现四肢抽搐。 KA潜伏期较长，癫痫发作症状较清晰：一开始行动迟缓，眼睛微闭，凝视，点头（0~2级），到后来单侧前肢阵挛（3级），双侧前肢痉挛并直立（4级），强直性痉挛并倒地（5级），其中3级症状次数较多。 匹罗卡品造模方法潜伏期较长，癫痫发作等级较高，其死亡率相对于其他两 组高。注射匹罗卡品后，小鼠初期表现为运动不能、面部抽搐、单肢阵挛、湿狗样抖动、点头和平衡失调等，之后很快出现肢体强直阵挛伴有站立及前肢阵挛等边缘系统运动性发作表现，最后大多数小鼠出现全身强直-阵挛发作伴有站立、蹦跳，反复出现呈癫痫持续状态。 匹罗卡品模型可以根据具体实验现象适当延长给药间隔或者降低单次给药剂量，防止因现象出现不及时而导致连续过量给药，从而导致小鼠死亡率较高。 本实验容易受主观因素影响，每个人对不同症状的判断标准有偏差，可能导致观察指标的不同，因此实验应由同一个人同一时期进行，并尽量保证观察指标的一致性。 |
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