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题目：Agave REVEILLE1 regulates the onset and release of seasonal dormancy in Populus 刊名：Plant Physiology 作者：Degao Liu， Xiaohan Yang et al 单位：Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory 日期：22 December 2022    01 摘要  杨树 ( Populus spp.)等落叶木本植物具有季节性芽休眠。同时延迟秋季芽休眠的开始和春季提前发芽一直是一项挑战，因为芽休眠和发芽被认为是由不同的遗传因素控制的。在这里，我们证明来自龙舌兰( Agave americana ) 的REVEILLE1基因（命名为AaRVE1 ）的异源表达不仅延迟了芽休眠的开始，而且在田间试验中加速了杨树的芽破。AaRVE1异源表达使温室中的杨树生物量产量增加了 166%。此外，我们揭示了AaRVE1的异源表达增加细胞分裂素含量，抑制多个休眠相关基因，并上调芽裂相关基因，AaRVE1作为转录抑制因子发挥作用并调节休眠相关蛋白1 ( DRM1 ) 启动子的活性。我们的研究结果表明，AaRVE1似乎作为芽休眠和破芽的调节剂发挥作用，这对于延长无霜温带和亚热带地区落叶乔木的生长季节以提高作物产量具有重要意义。 02 技术路线  AaRVE1 (Aam022373)融合到两个 FLAG 标签用于产生嵌合基因构建体 杨树（P. tremula × P. alba 717-1B4）用于遗传转化。具有相似株高的转基因、WT 和 EV 植物在温室中生长并在室外驯化两周，然后于 2019 年 8 月 15 日和 2020 年 7 月 28 日移植到田间。 记录了植物高度、茎粗、芽和枝条长度、芽休眠 植物激素分析、转录组测序、蛋白质结构建模 原生质体中的亚细胞定位 转录活性测定 系统发育分析 转录组测序 蛋白质结构建模 03 主要结果 3.1 在为期 2 年的田间试验中，单个AaRVE1基因的异源表达延迟了芽休眠 AaRVE1编码序列被克隆到花椰菜花叶病毒 35S (CaMV35S) 启动子的下游，进入双元载体 pBI121 以产生 p35S: AaRVE1 (补充图 1）。使用农杆菌介导的转化将 p35S：AaRVE1构建体和空载体 (EV) (pBI121) 改造成杨树“717-1B4”两个独立的转基因品系（L6 和 L11）表现出不同的AaRVE1表达水平（图 1A）被选为后续分析的代表性品系，连同 EV 和野生型 (WT) 对照。 为期2年的现场试验在康涅狄格州斯托尔斯进行（北纬 41.8048°，西经 72.2930°）。转基因 和 WT 植物于 2019 年 8 月 15 日和 2020 年 7 月 28 日在田间种植（补充图 2）。当 2019 年 9 月下旬和 10 月上旬温度下降到 10°C，日长减少到不到 12 小时时（图 1B；补充图 2），所有 WT（8/8）和 EV（3/3）植物逐渐进入休眠并停止生长（图 1C）。 2019年转基因株系L6（9/9）与对照相比休眠略有延迟，而转基因株系L11（6/6）的所有植株AaRVE1表达平均高于 L6，继续生长直到 11 月初，当时温度降至 0°C 以下（图 1C)， L11的顶芽在11月中旬逐渐产生休眠样表型。 2019 年冬季，所有 L11 植物的顶芽和茎长度为 2.0-8.5 厘米（从茎尖开始计算）被零下温度杀死。2020 年，所有 EV 植物（6/6）都去休眠并在 10 月 18 日左右停止生长，而 42.9%（3/7）的 L6 植物和 66.7%（4/6）的 L11 植物继续生长，直到 10 月 31 日降雪和低温（-6.1°C）到来（图 1，B 和 D）。 2019 年 11 月 5 日，WT 和 EV 对照植物的高度比其初始高度高 1.2 倍，而 L11 植物相对于其初始高度高 2.7 倍（补充图 3）。L11 的高度从 10 月 11 日到 11 月 5 日增加了 4 厘米，而在 WT 和 EV 植物中没有观察到生长。L11 还表现出比 WT 显着更大的茎直径和节间长度（补充图 3）。 这些结果表明， AaRVE1的异源表达显着延迟了芽休眠并加速了秋季杨树的生长。2020年10月3日至18日L11和L6株高分别平均增加7.6和3.5厘米，而EV仅增加0.8厘米（补充图 4）。10 月 18 日，转基因AaRVE1植物和 EV 植物之间的生长增加比率没有显着差异。2020年9月下旬日最低气温远高于2019年末，如2020年9月27日日最低气温17.8℃，2019年9月27日日最低气温7.8℃ C (图 1B). 与 2019 年相比，2020 年秋季的 EV 植物推迟了芽休眠的开始，这可以减少转基因AaRVE1植物与 EV 之间的生长增加率差异。
2019年，所有L6植株（9/9）与对照相比休眠略有延迟，而所有L11植株（6/6）持续生长至11月初温度降至0℃以下。L11的顶芽在11月中旬逐渐转为休眠表型。2020年，所有EV植物（6/6）在10月18日前后进入休眠停止生长，而42.9%（3/7）的L6植物和66.7%（4/6）的L11植物继续生长直到10 月 31 日的降雪和低温（-6.1°C）。 3.2 单个AaRVE1基因的异源表达加速了芽分化 为了测试AaRVE1的异源表达是否可以加速杨树的芽裂，我们在温室和田间条件下进行了实验。对于温室实验，转基因和野生型植物于 2019 年 12 月 26 日和 2020 年 12 月 2 日从田间移出并移植到温室中，每 2 年一次。2019 年 12 月 26 日移植的 L11 植株于 2020 年 1 月中旬发芽，比 WT 提前约 2 周。2020 年 2 月 4 日，L11 植物形成完全展开的叶子，而 WT 刚刚萌芽（图 2A）。同样，与 EV 植物相比，2020 年 12 月 2 日移栽到温室中的 L6 和 L11 植物均显示出更早的萌芽（图 2B ）). 此外，与 L6 相比，具有更高转基因AaRVE1表达的 L11 显示出更早的芽裂（图 2，A 和 B）。 在田间，L6 植物的顶芽在 2020 年 4 月中旬变得比 WT 更黄（图 2C ）。请注意，L11 植物的顶芽在 2019 年冬季被霜冻杀死。随后，中上芽L11 植物的芽变得细长、变薄和淡黄色，而 WT 和 L6 的芽短且呈棕红色（图 2C）。与 L6 植物相比，WT 植物的芽呈深棕色。5 月初，与对照相比，转基因植物（L6 和 L11）的中上芽更加健壮。L6 和 L11 芽的长度明显长于 WT，L11 芽明显长于 L6 芽（补充图 5）。到 2020 年 6 月 20 日，WT 植物和表达AaRVE1的 L6植物在主茎上形成了正常的顶芽。同时，L11系的顶生枝条在冬季被低温杀死，形成了三个均匀且生长旺盛的枝条（补充图 6）。在2019年8月至2020年9月22日的生长期，WT和EV株高分别增加了7.2倍和6.7倍，L11和L6株高分别增加了7.1倍和6.8倍，相对于它们的初始高度（补充图 6）。表达AaRVE1和 WT 的转基因植物之间没有显着差异（使用双尾学生t检验确定统计显着性。P < 0.05 被认为具有统计学意义。），可能是由于 L11 和 WT 中顶芽优势的丧失其对增长的影响。 在2021年，L6的芽与EV相比表现出更早的萌芽（图2，D和E）。请注意，L11 的上部芽和茎在 2020 年冬季再次被冰冻温度杀死（补充图 7）。总的来说，在两个生长季节，这些结果表明，在温室和田间生长条件下， AaRVE1的异位表达显着加速了春季杨树的发芽。
3.3 AaRVE1异源表达使温室中的杨树生物量产量增加 166% 我们在冬季在田纳西州橡树岭国家实验室的温室（26.7°C 和 16 小时光周期，通过补充照明延长日长）中种植转基因植物和野生型植物。L6 和 L11 在冬季温室中表现出更快的生长，与 WT 对照相比，生物量产量增加高达 1.66 倍，株高、叶长、叶宽和茎粗更高（图 3A-F） .
3.4 AaRVE1的异源表达增加细胞分裂素含量 植物激素调节植物的生长、发育和休眠过程。细胞分裂素 (CK) 促进休眠的释放。为了探索AaRVE1调控杨树转基因植物休眠的分子机制，我们对温室种植的转基因植物和 WT 植物进行了植物激素分析，发现 CKs（即反式玉米素和反式玉米素核苷）的含量在转基因AaRVE1植物中显着高于 WT 植物（图 3，G 和 h），表明AaRVE1通过增加 CK 含量来调节休眠。 3.5 AaRVE1抑制多个休眠相关基因 为了进一步探索延迟芽休眠和加速芽裂的分子机制，我们对转基因株系和对照进行了 RNA 测序（RNA-Seq）分析（补充表 1和补充图 8）。在转基因植物和对照植物之间发现了显着差异表达的基因（DEGs）（补充表 1）。我们发现 61 个 DEG 和 54 个 DEG 分别与AaRVE1表达呈显着正相关和负相关（|相关系数| ≥ 0.7， P < 0.05；图 4A；补充表 2 )。在图 4A-C中突出显示了与芽休眠和芽裂有关的基因。其他基因总结于补充表 2。休眠相关蛋白 1 ( DRM1 ) 是植物物种中众所周知的“休眠”标记。与 WT 相比， DRM1的表达水平在 L11 和 L6 中降低（图 4B）。 此外，在转基因杨树植物中，DRM1 的转录水平与AaRVE1的表达显着负相关（ r = -0.755， P < 0.0001）。无顶端分生组织家族蛋白 NAC2 和热休克转录因子 C1 (HSFC1) 与植物休眠相关。 在这里，我们发现 NAC2 和 HSFC1 的转录水平与 AaRVE1呈负相关，分别为r = −0.871 ( P < 0.0001) 和r = −0.834 ( P < 0.0001)（图 4，A 和 B；补充表 2 )。总的来说，这些发现表明AaRVE1通过抑制休眠相关基因的表达来抑制季节性休眠（图 4C）。 MADS 结构域蛋白 FLOWERING LOCUS C (FLC)-like 及其同系物 MADS AFFECTING FLOWERING (MAF)-like 成为在生态休眠期间抑制芽生长的有希望的候选者。最近的一项研究还表明，MdFLC-like可能会在冬季温度较低时的内休眠和生态休眠结束期间阻止休眠芽的生长。 在这里，我们发现 MAF4a 和 MAF4b 的转录水平与AaRVE1的表达显着负相关（图 4，A 和 B；补充表 2 )。这些发现表明， AaRVE1通过抑制芽生长抑制因子（例如MAF4a和MAF4b ）来促进芽生长（图 4C）。
3.6 AaRVE1上调芽裂相关基因 植物生长，包括休眠后的恢复生长，包括细胞分裂和细胞伸长。最近，据报道FERONIA促进细胞伸长和CYCLIN A3;4 ( CYCA3; 4 ) 增加了拟南芥中的细胞数量。 在这里，我们发现FERONIA和CYCA3 的表达水平与4 个推定的直系同源物与AaRVE1的转录水平呈正相关（图 4A-B，补充表 2 )，表明AaRVE1介导的芽裂和活跃生长促进涉及FERONIA和CYCA3;4 的上调（图 4C）。 3.7 MYB 转录因子AaRVE1作为转录抑制因子发挥作用 为了进一步深入了解 AaRVE1 对休眠相关基因的调控，我们使用 AlphaFold 2 (AF2, V2.0.1) 进行了从头结构预测。AF2 结构表明 AaRVE1 蛋白具有 MYB 结构域（V35 至 K92）（图 5A；补充图 9 )，与 RVE1 的转录因子功能一致。 我们还对AaRVE1在杨叶叶肉原生质体进行了蛋白质亚细胞定位分析和转录活性测定将与黄色荧光蛋白 (YFP) 融合的AaRVE1和与 mCherry 标签融合的核标记 (mCherry-VirD2NLS) 共转染到杨原生质体中。YFP-AaRVE1 融合蛋白的荧光信号与 VirD2NLS 重叠（图 5B），表明 AaRVE1 蛋白定位于细胞核，可能调节其靶基因的转录。 在转录活性测定中，AaRVE1不能激活GUS报告基因，而阳性对照转录激活结构域 VP16有力地激活了GUS表达（图 5C）。相反，与阴性对照相比， AaRVE1显着抑制了GUS的表达（图 5D），表明AaRVE1作为转录抑制因子发挥作用。
图5 MYB 转录因子AaRVE1作为转录抑制因子发挥作用并调节休眠相关蛋白 1 ( DRM1 ) 启动子的表达。 A，使用 AlphaFold2 对 AaRVE1 进行蛋白质结构建模。AaRVE1 有一个被 IDPR 包围的折叠 MYB 域。显示了具有最佳整体预测局部距离差异测试 (pLDDT) 分数的预测结构。紫色圆柱体是 MYB 域的螺旋。预测 β 发夹（黄色）具有相对较高的 pLDDT 分数。除了两个折叠区域（Myb 域和 beta 发夹），蛋白质的其余部分是无序的（白色：线圈；青色：转弯）。 B, AaRVE1 与核标记 VirD2NLS 在杨树中共定位原生质体。YFP：黄色荧光蛋白。 C, AaRVE1 没有激活活性。AaRVE1 与 Gal4 结合域 (GD) 融合，并在杨树原生质体中测量其对报告基因 (Gal4:GUS) 的激活。 D，AaRVE1 具有抑制活性。在原生质体中测量了 GD-AaRVE1 对报告基因的抑制（LD-VP16 激活的 LexA-Gal4:GUS）。对于 LD-VP16，转录激活因子 VP16 与 LexA 结合域 (LD) 融合。 E 和 F，AaRVE1 抑制休眠相关蛋白 1 ( DRM1) 原生质体中的启动子。在报告构建体 35S-P-DRM1:GUS 中，DRM1 启动子区域被克隆到 CaMV 35S 启动子的下游和 GUS 报告基因的上游。 3.8 AaRVE1 抑制休眠相关蛋白 1 (DRM1)启动子的活性 鉴于众所周知的休眠标记DRM1的转录水平与AaRVE1的表达显着负相关，我们假设AaRVE1直接调节DRM1启动子活性。为了检验这一假设，我们将DRM1启动子区域克隆到 CaMV 35S 启动子的下游和GUS报告基因的上游 (35S-P-DRM1:GUS)。报告构建体 35S-P-DRM1:GUS 与 35S:GFP（阴性对照）或 35S:AaRVE1 构建体共转染到杨树中原生质体。正如预测的那样，与 35S:GFP 载体相比，35S:AaRVE1 载体的共转染降低了 GUS 活性（图 5E），表明 AaRVE1 直接抑制DRM1表达（图 5F）。 3.9 杨树RVE基因序列分析及表达分析 通过在 Phytozome ( https://phytozome-next.jgi./blast-search ) 中实施的 BLAST 分析，我们发现 AaRVE1 蛋白（长度为 488 个氨基酸）具有 39% (178/453) 的氨基酸同一性与水稻 RVE1 相关基因 (LOC_Os06g51260.1)、与杨树 RVE1 相关基因 (Potri.004G074300.1) 的氨基酸同一性为 38% (184/484)，与拟南芥RVE1的氨基酸同一性为 46% (121/263) (AT5G17300.1)。 此外，我们的系统发育分析表明，杨树的 4 个 RVE 直向同源物和拟南芥的 4 个 RVE 直向同源物属于同一个进化枝，水稻的 3 个 RVE 属于另一个进化枝，而 AaRVE1 属于一个单独的进化枝（补充图 10）。 杨树RVE基因(Potri.004G074300、Potri.017G144800和Potri.012G038300)在休眠开始时的转录水平低于芽发红后的转录水平。这些数据连同我们的AaRVE1过表达结果表明， RVE充当杨树芽休眠和芽裂的调节剂。此外，“休眠”标记基因DRM1在休眠开始时的转录水平高于花蕾冲红后的水平（补充图 11 ），这与DRM1在休眠中的作用一致，并且与我们发现AaRVE1抑制 DRM1 的启动子活性一致。  04 结论 总之，我们证明AaRVE1通过抑制多个休眠相关基因和上调萌芽相关基因来调节芽休眠和萌芽。这些发现对于在无霜地区开发“常生”树木作为提高作物产量和加强碳固存以缓解气候变化的手段具有重要意义。 05 原文获取 原文链接： https://academic./plphys/advance-article/doi/10.1093/plphys/kiac588/6956333 END 06 广告 |
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