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基金项目：国家自然科学基金项目（81874373，82074235）作者：张悦怡1 刘田园1 王钐1 戴璇1 刘亚鸽1 卢美希1 王丽丽2 张东伟1**通信作者：张东伟，Email：zhdw1006@163.com 肠道菌群（gut microbiota, GM）是人体内密度最大的微生物群落，能影响机体的生理病理状态。本文利用中国知网、PubMed等数据库，以GM、骨代谢、骨质疏松等为关键词，检索了近20年国内外相关文献，发现GM可能通过以下途径影响骨代谢：（1）影响钙的吸收、调节宿主的免疫系统和中枢神经系统等；（2）调节其代谢产物（如短链脂肪酸、次胆汁酸、吲哚类衍生物和多胺等）的含量；（3）调节雌激素、胰岛素样生长因子1、5-羟色胺等激素的水平。临床研究表明，粪便微生物群移植、补充益生菌和益生元或调节饮食结构可改善GM的组成，能抑制骨量的下降。因此，GM及其代谢产物可能成为骨质疏松症等骨代谢疾病的防治新靶点。 肠道菌群（gut microbiota，GM）是指寄居在人体胃肠道内的微生物群，其主要来源于母体，受后天环境因素和饮食影响，是人体内种类最多、密度最大的微生物群落[1]。目前研究发现[2]，人体胃肠道内生存着约超过100万亿个细菌，可以分为52个细菌门，其中厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门居主导地位，这些菌群在调节宿主生理功能如代谢、营养、免疫等方面发挥着重要作用。 骨代谢包括骨形成和骨重建等过程，其稳态受成骨细胞和破骨细胞调控。研究[3-4]发现，GM的改变会影响骨的强度和质量，在骨代谢稳态过程中发挥着重要作用。Sjogren等[5]发现C57BL6/J小鼠体内的GM与骨密度密切相关，该团队研究人员将常规条件饲养的小鼠盲肠内容物中的粪菌移植到无菌（GF）小鼠体内 4周后，GF小鼠的骨量显著增加。此外，常规小鼠长期灌服广谱抗生素，其骨骼再现GF小鼠的表型[6]。Schepper等[7]的研究也发现给正常小鼠移植骨质疏松小鼠的粪菌后，其骨质量明显下降。将年轻大鼠粪菌移植到老年大鼠体内，能改善老年大鼠在门和家族水平上的肠道稳态，提高其骨体积、骨小梁体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度[8]，这说明GM能直接影响机体的骨代谢。为了进一步探索GM与骨代谢的相关性，本文综述了近20年（2002-2022年）以来国内外GM与骨代谢相关的文献，以期为骨代谢疾病的防治提供新的方案。 根据机体反应性的不同，GM分为有益菌（益生菌）、中性菌和有害菌。益生菌被定义为活的共生微生物，如细菌或真菌，可以给宿主带来健康益处。正常生理状态下，益生菌可调节免疫细胞的发育和功能、促进食物消化与脂肪代谢、维持上皮细胞功能、调节肠道内环境稳态和促进血管生成、抑制有害菌和中性菌的过度生长繁殖，促进人体各系统间的平衡。 肠道中性菌本身对身体无害，甚至对益生菌有协同作用，但在某些病理条件下，中性菌大量繁殖，导致有益菌比例降低，可诱发GM稳态的失衡。而以变形菌门为代表的有害菌则可使机体产生炎症、诱发肠道屏障功能失常以及成骨细胞和破骨细胞功能异常激活[9]等不良反应，导致疾病的发生。 钙是人体骨骼中主要矿物质元素，对骨骼的形成至关重要。营养学调查研究[10]显示，正常膳食中摄入的钙仅有30 %会被骨骼吸收，因此提高钙的吸收率，可以促进骨的生成。钙在正常人体中以钙离子的形式被消化吸收，研究[11]发现，GM可通过调节肠道pH、改善肠绒毛结构、增加肠道延展性等途径提高钙离子吸收率，调节骨代谢。 免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，具有免疫监视、免疫防御和免疫调控的功能。免疫细胞与骨细胞均来源于骨髓，具有共性的调节因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1和IL-6等）和干扰素γ（IFN-γ）等，既可以调节免疫系统，又影响破骨细胞和成骨细胞的功能。GM与树突状细胞、免疫细胞在内皮层的边界不断接触，可刺激免疫系统释放炎症因子并影响骨组织免疫细胞群，从而调节骨骼的重塑[12-13]。例如，在肠道内壁激活的调节性T细胞（Tregs）可以迁移到骨髓中，对骨内膜和骨小梁的重塑产生影响[14]。 GM可影响宿主免疫系统的发育和成熟。研究发现，GF动物具有不成熟的粘膜免疫系统，肠相关淋巴组织（GALT）发育不良，尤其是GF小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结的形成存在缺陷，同时伴有CD4+T细胞数量和IgA生成的减少。Sjögren等[5]发现，GF小鼠的破骨细胞数量减少，骨中IL-6、RANKL和TNF-α水平降低，而这些细胞因子具有促炎症和促破骨细胞生成作用；同时发现GF小鼠移植常规饲养小鼠的GM后，其免疫系统可恢复至正常水平。 GM能通过以下途径调节机体的免疫功能，进而影响骨代谢（图1）：（1）GM可促进抗体反应，通过调节基因表达促进B细胞的分化，增加机体IgA、IgG等抗体的产生，维持肠道屏障功能；（2）GM的代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）对肠道巨噬细胞发挥免疫调节作用，诱导Tregs分化，还可以诱导T辅助细胞分化为Th1和Th17，从而增强宿主对病原体的防御能力；（3）GM可调节与炎症相关细胞因子的水平。Mazmanian等[15]发现给GF动物移植脆弱类杆菌，能重建其体内Th1和Th2细胞之间的平衡，进而引导淋巴器官的重新形成。GM通过影响Th细胞的发育和Tregs分化，调节肠道Tregs与Th细胞的平衡[16]，进而改变肠道乃至全身的内环境状态，调节破骨细胞及成骨细胞功能，影响骨吸收和骨形成的动态平衡[17]。 中枢神经系统和肠道微生物群以化学信号（如乙酰胆碱、γ-氨基丁酸和5-羟色胺等）为介质将信息在大脑和肠道间的相互传递，这种信号转导途径称为“肠-脑轴”。研究[18]发现，乳球菌、黏液杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌等与瘦素浓度呈正相关；梭状芽孢杆菌、普雷沃特氏菌、细菌和阿洛巴氏菌等与瘦素水平呈负相关。瘦素与脑干神经元中表达的瘦素受体（Ob-Rb）结合后，会抑制脑干神经元中5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）释放和5-羟色胺受体2C（HTR2C）在下丘脑腹内侧（VMH）核上表达，并通过成骨细胞中表达的β2肾上腺素能受体（Adrβ2）促进骨吸收[19]。反之，当瘦素浓度降低时，5-HT的释放可降低交感神经活性，从而影响骨代谢的平衡（图2）。 在机体代谢过程中，GM可产生许多活性物质，如SCFAs、次胆汁酸、三甲胺-N-氧化物（TMAO）、吲哚类衍生物和多胺等，这些代谢产物可通过肠道扩散至体循环，调节机体代谢。值得注意的是，在探讨肠道菌群对骨代谢的影响方面，由于研究者所用无菌小鼠、抗生素干预方式或者单一肠道菌群移植小鼠等方面的不同，肠道菌群变化的趋势也不相同，因此最终得到的实验结论也不完全一致。同时，实验结果还受到干预时间、动物年龄、种属、性别、生长环境等方面的影响。而GM代谢产物相对比较稳定，能间接地揭示GM对骨代谢的作用，受到了越来越多研究者的关注。 SCFAs是一类链长为1~6个碳原子的饱和脂肪酸，由GM将不易消化的碳水化合物发酵代谢而来，包括醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐。此外，GM中的氨基酸发酵也会产生SCFAs。Donohoe等[20]发现，肠道微生物菌群能影响机体的能量稳态。其中，丙酸盐和乙酸盐主要被肝脏吸收，是生成葡萄糖的主要来源。而丁酸盐作为重要的能量来源，可调节肠道内激素水平，提高胰岛素敏感性，同时与丙酸盐一起可通过肠-脑轴促进肠道糖异生作用，刺激脂肪酸氧化，抑制肥胖和胰岛素抵抗，维持肠道内环境稳态。而葡萄糖代谢为成骨细胞和破骨细胞分化和形成提供能量来源，当能量代谢异常时，成骨前体细胞会从成骨细胞分化转化为向脂肪分化[21]。 SCFAs可能通过以下两种途径影响免疫系统：（1）抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的活性，诱导Tregs生成，维持免疫系统稳态；（2）细胞表面G蛋白偶联受体（尤其是FFAR2受体）结合后，可降低细胞内cAMP水平，激活免疫系统，促进Tregs的增殖与分化，抑制肠道炎症和破骨细胞的分化[22]，进而调节骨代谢。 SCFAs还可以降低肠道pH，减少与钙离子结合的如磷酸钙等无机盐的形成，同时SCFAs中的丁酸盐可以刺激肠黏膜细胞增殖，扩大肠上皮表面积，进而提高机体钙的吸收能力[23]。此外，SCFAs可选择性地提高丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38的磷酸化水平，介导下游底物热休克蛋白27（HSP27）在Ser78和82位点磷酸化[24]，通过影响矿物质吸收，提高骨骼质量（图3）。 三甲胺-N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）是膳食胆碱的肠道微生物依赖性代谢物。研究[25]发现，TMAO可通过激活炎症反应，并上调NF-κB信号通路减少骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖，抑制其向成骨细胞分化，导致骨代谢失衡。 初级胆汁酸在肝脏中形成胆汁盐，分泌到小肠中，经过GM的生物代谢，生成次胆汁酸。GM可以改变初级胆汁酸的数量和类型，从而产生不同的代谢效果，影响胆汁酸的代谢。同时，次级胆汁酸可以作为维生素D受体的配体，调节1,25-二羟基维生素D3的代谢，对骨稳态和矿物质平衡起着重要的作用[26]。 吲哚衍生物可刺激抗微生物肽、粘液蛋白的生成和肠道绒毛细胞的增殖，抑制病原体的异常繁殖，进而维持肠道粘膜的完整性。多胺类物质，如腐植酸、亚精胺和精胺可调节基因表达并促进肠上皮细胞的增殖，维持肠道的屏障功能并通过影响免疫系统的功能进而调节骨代谢[27]。 雌激素是一种主要由卵巢分泌的类固醇激素，其可以促进成骨细胞的生成和破骨细胞的凋亡，对骨代谢发挥调节作用。Ma等[28]研究发现，去卵巢诱发的骨质疏松模型大鼠的GM严重失调，厚壁菌门与拟杆门细菌比值显著增加，其中瘤胃球菌属、梭菌属和粪球菌属与破骨细胞骨吸收呈正相关；而GM中拟杆菌属和丁酸弧菌属与骨量丢失呈负相关。 雌激素缺乏导致的骨质疏松症与GM密切相关。研究[29]发现，GF小鼠或长期服用抗生素的小鼠，缺乏雌激素不会导致大量的骨质流失。而正常动物雌激素缺乏时，其肠道通透性增加诱发GM紊乱，大量致病菌进入肠道，一方面通过髓基质细胞和成骨细胞分泌RANKL和M-CSF等信号分子，促进破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，以及破骨细胞的生成；另一方面通过影响免疫系统，促进Th17细胞分化，刺激促炎细胞因子如TNF、IL-17和IL-1的分泌。TNF可通过NF-κB（RANK）受体激活剂的激活和Th17细胞的诱导，刺激RANKL分子的进一步增加，促进破骨细胞的形成和骨吸收，并同时降低了成骨细胞的骨形成能力，从而诱发骨质疏松[30]（图4）。 胰岛素样生长因子1（IGF-1）主要通过Akt-mTOR途径调节并诱导eNOS水平持续升高，从而促进成骨细胞分化与炎性因子表达，进而影响骨代谢。Yan等 [31]的研究表明，GM能增加血清中IGF-1的含量而促进骨的生长。将常规肠道微生物菌群移植到GF小鼠体内，其血清、肝脏和脂肪组织内的IGF-1水平均显著增加。相反，抗生素的干预能降低常规小鼠IGF-1的水平而抑制骨的形成。然而，给抗生素干预的小鼠补充SCFAs，能抑制其血清中IGF-1含量的降低。这说明GM可能通过IGF-1影响骨骼的生长。 5-HT是一种与骨细胞相互作用的分子，通过增加骨形成和抑制骨吸收对骨量产生积极影响。GM可以调节肠道5-HT的产生，肠源性5-HT可通过Htr1b/PKA/CREB/细胞周期蛋白信号调节成骨细胞增殖[32]。 甲状旁腺素（PTH）是由甲状旁腺产生的、调节钙代谢的一种多肽类激素，可以影响骨形成和骨吸收，连续使用PTH会导致骨质疏松症[33]，而间歇性PTH干预则会促进骨形成 [34]。然而，连续或间歇性的PTH干预GF小鼠或连续使用抗生素的常规小鼠，其骨小梁的体积分数均无明显改变[14]。研究[34]发现，PTH通过丁酸盐增加骨髓Tregs的数量，Tregs通过BM CD8 T细胞刺激成骨Wnt配体Wnt10b的产生，从而激活Wnt信号传导通路，刺激成骨细胞增殖分化，促进骨形成。 益生菌能产生直接影响上皮细胞和免疫细胞的基因和代谢物，通过改善肠道功能、降低炎症因子含量、降低肠道pH值促进钙吸收以及抵抗有害细菌的菌落，进而促进成骨细胞的骨形成，维持骨骼健康[35]。试验[36]证明，每天服用益生菌可以减少绝经后的骨质流失。一项关于罗伊氏乳杆菌（lactobacillus reuteri）的研究[37]表明，健康受试者服用该益生菌后，其血清25OH维生素D水平明显升高，机体的钙吸收明显增加。 益生元是一种由GM发酵、耐胃酸和水解酶而不被肠道消化吸收的食物成分，其可选择性调节一种或多种对宿主有益GM的活性。Inulin型益生元可增加肠道中“有益”细菌的数量，促进有机酸的释放，从而降低肠道的pH值而促进矿物质的吸收进而抑制骨量的丢失。临床研究表明[38]，服用低聚果糖（FOS）等可增加胃肠道中双歧杆菌比例，同时减少了拟杆菌科和产气荚膜梭菌的数量，其中双歧杆菌可增加成骨细胞的数量和活性[39]，进而提高骨质量。因此，补充益生菌和益生元，可以调节GM稳态进而改善骨骼质量。 饮食结构可以影响肠道微生物群的种类和肠道的功能。高纤维饮食和低聚果糖可增加双歧杆菌种类的数量，优化GM的微生物组成，提高SCFAs的含量，降低肠道内pH值，从而促进钙的吸收。Matkovic V等[40]研究发现 ，乳制品的摄入可促进骨的生成，抑制骨量的丢失。研究[41-42]也发现，60岁以上的成年人食用乳制品能降低骨质疏松症风险，部分原因是乳果糖衍生产品中的乳果糖含量与益生菌一起降低血清PTH水平，从而降低骨吸收标志物的含量。 总之，GM能通过调节宿主代谢、钙的吸收、机体激素水平、免疫系统和中枢神经系统等途径直接或间接（其代谢产物）影响骨的形成和重建。而GM代谢产物，能稳定地反应机体GM对骨代谢的影响，可能是骨质疏松防治的新靶点。益生菌、益生元以及高纤维和低聚糖的摄入能改善GM的组成，促进钙吸收和骨形成。补充益生菌和益生元以及调整饮食结构，可能为骨质疏松症等骨代谢疾病的防治提供新思路。这也提示，GM及其代谢产物可能是未来基础研究和临床管理骨代谢性疾病的主要方向之一。（参考文献略）
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