ELISA实战案例分享——数据处理

之前的几期课堂讲座给大家分享了ELISA实验的原理，操作步骤以及实验中的常见问题（感兴趣的小伙伴可以去视频专区收看），近期又收到部分小伙伴的反馈问题，主要集中在数据处理上。小编看了也觉得比较可惜，整个ELISA实验做得不错，可惜在最后的数据处理上犯了错误，直接导致实验结果出了大问题，可谓功亏一篑。接下跟着小编进行一次实战案例的分析，详细了解一下爱必信ELISA试剂盒的数据处理过程吧~

话不多说，先上图：

图一. 客户提供原始OD值图（涉及未发表数据，部分隐去，部分略作处理）

图二. 客户处理的标准曲线图

客户反馈，部分数据OD出现负值，无法处理，觉得试剂盒有问题。小编接到这个case之后，简单的看了一下客户的数据，就发现几个明显的数据处理问题，而根据客户的原始OD数据，初步判断，试剂盒是正常的，并且实验数据还比较可靠。不知道是否有聪明的小伙伴已经从这个数据中发现了问题呢？没关系，跟着小编一起来抽丝剥茧的详细分析一下吧~

1. OD值出现负值

大量样品孔的读值为负数，但接近零点，小编看了一下客户标曲的0点OD值接近0，初步判断客户是用空白孔进行校准，但空白孔由于操作污染等原因，OD值偏高，进而导致样品孔OD值为负。跟客户沟通之后，确实是进行了空白孔校准。

沟通之后，确认原始空白孔读值为0.0962，明显偏高，正常OD450的空白孔读值应为0.06左右。

在这里，小编建议有条件的小伙伴，尽量要用我们推荐的双波长校正法，使用570或630nm波长进行校正，OD450 - OD570/630即为校正后的OD值，可直接用于计算，也可根据数据质量，再进行空白校正。如没有双波长的酶标仪，读取OD450数据后，应先判断数据质量，再进行空白校正。

小编将空白校正进行补回，得到的OD450原始数据如下：至此，样品孔数据出现负值这一问题解决。

图三. 经还原处理的OD450原始数据图

2. 标曲拟合问题

处理完了负值问题，还有一个很明显的问题就是，客户的标曲拟合问题。我们这款试剂盒（Mouse TNF alpha ELISA Kit，abs520010）标曲最高点是2000 pg/ml，客户给我的截图（图二）只到250 pg/ml，再仔细研究一下，发现客户的拟合方式用的竟然是直线拟合。跟客户沟通之后，确认原因，客户选择直线拟合，高点不符合拟合方式，R²值过低，所以客户自己把上面高浓度的点去掉了，只选取到250 pg/ml，进行直线拟合。在这里，小编强调一下， 爱必信ELISA试剂盒推荐拟合方式为四参数拟合，四参数拟合，四参数拟合，重要的事情说三遍。不要再用其他稀奇古怪的拟合方式进行拟合啦。就像这个客户犯的错误，虽然看似250 pg/ml以下的点可以用直线拟合，但是表达含量较高的样品，OD值高时，就不符合他拟合的这条直线了，会导致结果出现严重偏差。由于0孔出现问题，小编在拟合标曲时，将OD值最低的孔作为空白孔，TNF-α在正常样品中表达含量极低，可视为0，拟合曲线如下：

图四. 四参数拟合的曲线图及方程

回归计算之后得到样品浓度，部分无法计算出的样品孔，表达含量低于0点，按0计算即可。