蛋白桑：桑叶对肿瘤血管生成的影响

新用户0330Go0q 2023-02-01 发布于广西

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[摘要] 目的研究桑叶对肿瘤血管生成中血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。方法用CCK-8试剂盒测定HUVEC-2C细胞数量的变化；用Transwell转移小室研究HUVEC-2C细胞迁移情况；用包被Matrigel的24孔板来培养HUVEC-2C细胞观察其管腔形成情况。实验分为实验组和对照组，每组分别设置3个复孔，在实验组中加入桑叶浸出液。观察桑叶对肿瘤血管生成的影响。结果桑叶液可抑制HUVEC-2C细胞的增殖能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。在浓度为100、50、25 mg/mL时，与对照组比较，差异有统计学意义（P 　　目前，市场上销售的血管生成抑制药物大都成本高昂，作用途径比较单一，治疗不够彻底，副作用仍然较大，在实际应用中存在一些问题。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构发生了显著变化，世界各地相关学者专家都在极力寻求天然、安全、保健性食品药品的开发，这种回归自然的愿望已成为走向21世纪的趋势。探寻引起不良反应小的植物成分药已成为血管生成抑制剂发展的重要方向[3]。特别是低价易得植物材料，不但可以解决恶性肿瘤早期防治问题，同时也可充分降低治疗成本，给更多癌症患者提供更大的生存机会。

　　桑叶，作为古老的中药，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聪耳，镇静神经，润肺热，止咳的作用。近年来，有关学者致力于对天然、安全、保健性药食品的开发，通过对桑叶化学成分及生理功能的研究，发现其含有的黄酮类、生物碱等生物活性成分，具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，还能预防肿瘤细胞的生成[4-8]，被国家卫生和计划生育委员会列为药食两用植物。特别是类黄酮中的槲皮素能够抑制多种肿瘤细胞的分裂增殖，通过多种途径促进其凋亡，抑制肿瘤细胞迁移及侵袭，降低其耐药性等作用[9-13]。笔者从血管生成抑制方面来研究桑叶中有效成分对肿瘤生长的影响。

　　本课题通过探讨低价易得植物材料桑叶中的有效成分对肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成的作用，来探索其对肿瘤血管生成的抑制作用，判断桑叶有效成分抑制肿瘤血管生成的可行性，从而为肿瘤早期预防和治疗提供新的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　桑叶（日本株式会社黑姬和汉药研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批号C-003-2C）；PBS（pH为7.4，实验室配制）；DMEM高糖培养基（Biowest公司提供）；细胞消化液（Trypsin 0.25%-EDTA 0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；双抗（青霉素-链霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。

　　1.2 实验设备

　　超净工作台（SW-CJ-1B，苏州安泰）；电子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培养箱（CP-ST100A，长沙长锦科技）；超声处理仪（JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；旋转蒸发器（RE-52CS，上海雅荣生公司）；酶标仪（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物显微镜（LWD200-37T，上海测维光电）等。镊子；手套；无菌针管；0.22 μm针头过滤器；2 mL PE试管；50 mL离心管；烧杯；量筒；双蒸水；培养皿；离心管；25 mL细胞培养瓶（Corning）；96孔细胞培养板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell转移小室（Corning）；血球计数器。

　　1.3 方法

　　1.3.1 桑叶有效成分的提取[14-15] 精确称取桑叶粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超声频率下超声30 min后过滤，并将滤渣用60 mL 75%的乙醇再次超声30 min。将得到的两次滤液合并超声混匀，再用0.45 μm的滤纸过滤。滤液用旋转蒸发器在0.08 mPa、60℃的环境下蒸发2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性针头过滤器过滤除菌，最终得到的桑叶液浓度为100 mg/mL，依次两倍梯度稀释至50、25、12.5 mg/mL。

　　1.3.2 细胞培养实验中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）进行培养，用含0.25%胰蛋白酶（0.02% EDTA）消化传代。二氧化碳培养箱环境设置为5%CO2，37℃。

　　1.3.3 增殖实验取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、计数，控制细胞数量至5×104个/mL。在96孔板中设实验组（100、50、25、12.5 mg/mL）、阳性对照组、阴性对照组，每组设3个复孔，在实验组和阳性对照组中分别加入每孔100 μL的细胞悬液，阴性对照组加入100 μL培养基。在96板内培养HUVEC-2C 8 h直至细胞完全贴壁。在实验组中分别加入10 μL不同浓度桑叶制备液（100、50、25、12.5 mg/mL），阳性对照组、阴性对照组加入10 μL无血清的培养基。培养24 h之后将96孔板置于倒置显微镜下观察，发现细胞无异常生长情况，再在每孔中加入10 μL CCK-8检测试剂，1 h后用酶标仪在单波长450 nm处检测OD值。OD值与细胞密度成正比，OD值越大说明细胞密度越大，反之则越小。

　　1.3.4 迁移实验取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、重悬后计数，调整细胞数量至1×106/mL。在Transwell转移小室的上室每孔加入200 μL细胞悬液，下室加600 μL无血清DMEM培养基。细胞培养8 h后，在实验组的下室加100 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，对照组加100 μL无血清DMEM培养基，每组设3个复孔。将Transwell转移小室置于5%CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养8 h后，用PBS清洗小室内侧，棉球擦去上室内侧中的细胞。小室外侧细胞用无水酒精固定30 min，结晶紫染色30 min。洗净后置于倒置生物显微镜下观察、拍照并分析。

　　1.3.5 管腔形成实验用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室温下放置30 min使Matrigel凝固。取出对数生长期的HUVEC-2C，消化、重悬后计数，调整细胞数量至5×105/mL。实验组和对照组每孔接种500 μL细胞悬液。此外，对照组不加桑叶浸出液，实验组加50 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，每组设置3个复孔。将24孔板放入5%CO2，37℃培养箱中培养，8 h后置于倒置生物显微镜下观察，随机选3个视野拍照。　　

1.4 统计学方法

　　采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。

桑叶茶的五大保健功效

桑叶延年益寿的药理学研究
现代研究表明，桑叶能提高小鼠对高温刺激的耐受能力和防止由于应激刺激引起的大鼠肾上腺皮质分泌功能低下，而当肾上腺功能低下时，桑叶可使之恢复正常。用地塞米松使小鼠产生'耗竭'，桑叶则可减轻此现象的发生。桑叶能延长小鼠游泳及转棒时间，具有增强肌体耐力作用。桑叶能延长果蝇的寿命，能提高老年大鼠红细胞内SOD含量，从而能有效地清除生物氧化产生的超氧阴离子，并能降低老年大鼠大脑、脊髓组织脂褐质含量，表明具有延缓衰老作用。另有研究表明桑叶无中枢神经系统安定作用，对免疫功能无影响，无促进生长及性激素作用。桑叶茶药理及临床研究有较好的抗衰保健作用，以清补为其特色，尤宜于中老年人服用，该研究为中老年保健用药和利用蚕桑药源开拓了一条新路。
一、桑叶茶降血糖
日本神奈川县卫生研究所和养蚕研究所等从1990年起，启动了'开发未利用食品材料'研究项目。研究人员对桑叶进行化验、分析后确认，它含有一种脱氧霉素。可阻止糖分解酶发挥作用。桑叶原物具有抑制血糖上升的功能，其主要功能成份是桑叶中的'生物碱'，这是一种特殊的功能成份，它是其它动、植物所没有的。日本称这种特殊组成为'DNJ'物质。其主要作用是抑制蔗糖酶、麦芽糖酶、a--葡萄糖甘糖、a--淀粉酶的分解，能刺激胰岛素分泌，降低胰岛素分解速度；根据研究，桑叶的有效成份，其中钙、铁、钠的含量分别是茶的5倍、5倍、2、8倍。由此可见桑叶茶的功效之广。此外研究还发现，桑叶内的桑素（Mulberin）具有抗癌活性，并有抑制真菌的作用。

桑叶茶并不是现代人的发明，《本草纲目》记载，秋霜叶为'神仙草'，认为有止咳、预防高血压等功效。日本古书《吃茶养生记》记载，桑叶有改善'饮水病'（即糖尿病）的作用。现在，在中医治疗中，桑叶作为改善糖尿病及其他各种疑难杂症的药物而使用。

二、糖尿病的克星--桑叶茶
基于糖尿病缘于气阴两虚及兼挟瘀血、痰浊的认识，我国著名糖尿病专家何绍奇治糖尿病，常用自拟'四桑汤'为基本方（桑叶、桑椹、桑白皮、桑寄生）加减治疗。方中桑叶甘寒微苦，古方如桑杏汤、清燥救肺汤都用它来治疗燥热伤肺。现代药理研究认为桑叶的主要功能成分为生物碱--DNJ，能将葡萄糖从血液中转移到末稍组织中促进糖的利用与转化，使血液胰岛素增加，血糖含量下降。桑叶所含脱皮固酮能促进葡萄糖转化为糖元，可降血糖。桑椹甘寒，滋肝肾，补阴血，润肠道，《本草经疏》云：'甘寒益血而除热，为凉血补阴之药'，唐以前即用它治疗消渴。桑白皮性寒凉，有清泻肺火之功，《别录》说它能疗'热渴'，宋人方书中常用以之治疗消渴。桑寄生苦而甘平，除了可祛风湿、补肝肾、降血压、抗病毒外，还有活血化瘀的作用。
三、消疮祛斑桑叶茶
近年来的研究证明，桑叶还有良好的皮肤美容作用，特别是对脸部的痤疮、褐色斑有比较好的疗效。痤疮，俗称粉刺，是常见于青年人的一种炎症性皮肤病。中医认为，过食油腻辛辣食物，脾胃积热生湿，外邪侵犯皮肤则生痤疮。由于桑叶有清热解毒的功效，有人试用桑叶煎剂治疗痤疮258例，其收效达到89%以上。具体办法是，每日取桑叶15克，泡茶分三次喝，一般15天见效。取泡茶用桑叶适量，捣烂，敷痤疮处每日30分钟，也取得了满意的效果。用桑叶来治疗面部褐色斑，具体方法是：用桑叶茶500克，每日15克，沸水浸泡后作茶饮用，连服30天为一个疗程。一般服用30天后即有明显疗效，斑块消退或色素变浅。治疗期间应多吃些豆制品，如豆腐、豆芽等，可有事半功倍之效。
专家们认为，服用桑叶所以对皮肤褐色斑有良好疗效，与其对机体分泌功能的改善有关。同时，根据药理研究证明，桑叶富含黄酮化合物、酚类、氨基酸、有机酸、胡萝卜素、维生素及多种人体必需的微量元素，这对改善和调节皮肤组织的新陈代谢，特别是抑制色素沉着的发生和发展均有积极作用。另外，坚持常饮还有减少皮肤或内脏中脂褐质（即老年斑）的积滞。

四、桑叶茶减肥的奥秘
桑叶茶可以减肥，就是与桑叶'消肿'、'清血'的作用有关。桑叶茶之所以能够消肿，是因为桑叶有利水的作用。利水作用与利尿作用不同，不光可以促进排尿，还可以使积在细胞中的多余水分排走。所以桑叶茶能够改善所谓的水肿现象。清血是指将血液中过剩的中性脂肪和胆固醇排清。血液中的中性脂肪或胆固醇增加过多就是高脂血症。所以胖人多为高脂血症患者。桑叶有改善这种高血脂的作用。
另外，高脂血症病人的血液粘度高，在毛细血管中的流动特别不畅通。毛细血管只有我们头发的1/100那么粗，所以容易堵塞。心肌梗塞和脑溢血都是毛细血管堵塞的结果。桑叶中含有强化毛细血管、降低血液粘度的黄酮类成分，所以在减肥、改善高脂血症的同时，又有预防心肌梗塞和脑溢血的作用。
五、止汗妙品---桑叶茶
桑叶治汗出，由来已久。秦汉时期的《神农本草经》中记载：'桑叶除寒热、出汗'。被称为金元四大家之一的名医朱震亨（朱丹溪）在《丹溪心法》一书中记载：'经霜桑叶研末，米饮服，止盗汗'。（盗汗：入睡后不自觉的出汗，醒后即停止。）明末清初的名医傅青主，很擅长用桑叶止汗，他拟定有止汗神丹、遏汗丸、止汗定神丹等几个药方，都选用桑叶为主药，并称赞桑叶为'收汗之妙品'。其他医学文献如《本草撮药》也有：'以之代茶。取经霜者，常服治盗汗。'
当代上海著名中医颜德馨教授，根据《医学入门》中'思虑过度，以致……有汗出者，……青霜第二番叶，带霜采阴干，或焙为末，米饮调服'的记载，治疗一盗汗两年余的60岁老妇，别无所苦，饮食如常，惟觉精神疲惫，用霜桑叶研末，米饮调服9克，早晚各服1次，结果半月愈，终未复发。