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*仅供医学专业人士阅读参考 治疗性抗体广泛用于玻璃体内注射治疗眼底疾病，而使用眼药水配方治疗眼底疾病由于存在眼部屏障而相对较为困难。近日，来自苏州大学的刘庄、陈倩老师教授团队、上海交通大学医学院附属第九人民医院谷平教授团队苏州大学附属独墅湖医院张晓峰教授团队进行了基于滴眼液大分子眼科给药治疗眼底疾病的相关研究。研究成果以“Eyedrop-based macromolecular ophthalmic drug delivery for ocular fundus disease treatment”为题于2023年01月27日发表在《Sci. Adv.》上。  图1 实验流程及机制示意图 本文开发了一种创新的渗透性载体，用于在眼药水配方中输送抗体。氟碳改性壳聚糖（FCS）会与蛋白质自组装形成纳米复合物，可以有效穿过复杂的眼球结构，到达小鼠和兔子后眼节。在脉络膜黑色素瘤小鼠模型中，含有FCS/抗PDL1的眼药水可以诱发比静脉注射抗PDL1所引发的更强抗肿瘤免疫反应。此外，在脉络膜新生血管形成的小鼠和兔子模型中，FCS/抗VEGFA眼药水能有效抑制血管增生，达到与静脉注射抗VEGFA相似的治疗反应。本文提出了一种有效的递送载体，利用治疗性抗体的眼药水来治疗眼底疾病，使许多眼病的居家治疗成为可能。  图2 FCS/IgG纳米复合物表征 FCS由壳聚糖（CS）与全氟烷基羧酸（PFCA）通过酰胺偶联得到。从动态光散射（DLS）结果来看，发现所有具有不同氟碳替代程度带正电的FCS都能与带负电的IgG形成纳米复合物。氟碳取代度为4.9%的FCS与IgG混合后形成的纳米复合物表现出最均匀的尺寸，4℃下储存5周，尺寸均匀稳定。接下来，我们使用Franz扩散细胞与分离的兔角膜作为标准化方法来评估不同氟碳替代度的FCS对角膜的渗透能力。结果显示纳米复合物都显示出对角膜渗透能力增强。氟碳替代度为4.9%的FCS在Franz扩散池中显示出最高的角膜穿透力。进一步进行了角膜累积渗透实验，FCS/IgG-FITC纳米复合物的FCS:IgG比例为1:1和1:2时，其累积渗透率分别为4.02%和4.87%，明显高于其他组。为了评估FCS/IgG纳米复合物在体内眼屏障渗透能力，检测了FCS/IgG-FITC眼药水处理后不同时间点IgG-FITC在小鼠角膜、视网膜和整个眼球的分布情况，1小时后，在用FCS/IgG-FITC处理的小鼠眼球中，从角膜上皮到角膜内皮都能观察到IgG-FITC的显著荧光信号，而在用游离IgG-FITC处理的小鼠角膜中则检测到相当弱的荧光信号，总的来说FCS/IgG纳米复合物显示高渗透效率。  图3 增强FCS/IgG纳米复合物眼球传递机制 CS可以破坏细胞间紧密连接，以增加旁路输送。为了探索FCS是否也有穿越细胞旁路的能力，本文研究了人类角膜上皮细胞（HCECs）之间部分紧密连接相关蛋白如E-cadherin、occludin和Zonula occludens protein-1（ZO-1）的表达和分布。FCS和CS都明显引起了紧密连接相关蛋白的重新分布，特别是E-cadherin和occludin。同时，Western blotting显示，FCS处理的细胞中紧密连接相关蛋白水平几乎没有变化，而CS处理的细胞中其水平明显降低。CS会对上皮屏障系统造成不可挽回的损害，而FCS只会引发紧密连接相关蛋白的重新分布，不会影响其整体表达水平。细胞电阻测试也显示：加入FCS 1小时后，TEER的值下降了27%，12小时后在新鲜培养基中（去除FCS）恢复到正常水平。FCS可以暂时性地促进经眼球输送，而不会造成眼球结构屏障的永久性破坏。 通过Western blotting进一步研究FCS或CS处理后HCEC单层中MLCs和pMLCs的含量。FCS和CS处理后，其磷酸化水平上调，表明FCS和CS都能调节MLC的磷酸化以重新分配部分紧密连接相关的蛋白。用Transwell室研究抗体眼渗透能力，结果发现，FCS/抗PDL1和CS/抗PDL1配方中的抗PDL1都能成功通过HCEC单层，并与下层的B16F10细胞结合，而游离的抗PDL1显示出很小的渗透性。接下来，研究了FCS在体内对角膜紧密连接的影响，以及其对原蛋白的内部传递的能力。与对照组相比，在用FCS处理的兔子的角膜细胞之间的紧密连接处观察到了狭窄的缝隙，如门开裂，这表明FCS有能力重新安排兔子角膜上皮细胞之间紧密连接相关蛋白的分布，有希望通过细胞旁路途径将大分子眼科药物送入眼睛。  图4 用于治疗脉络膜黑色素瘤的FCS/抗PDL1眼药水 FCS实现大分子的高效眼球传递，研究人员随后评估FCS作为小鼠眼药水成分生物相容性。使用包括裂隙灯显微镜、光学相干断层扫描（OCT）和眼压计，分别在第2和第4周测量小鼠的荧光素角膜染色、角膜厚度、视网膜厚度和眼内压（IOP）来检测结果。第四周，在光照条件下通过视网膜电图（ERG）评估小鼠的视觉功能。用SDS处理的小鼠的角膜显示浑浊，有角膜缺陷和溃疡，而用PBS、FCS或CS处理的小鼠的角膜几乎没有异常。SDS处理组的角膜厚度增加，根据ERG测量的光斑条件下A波和B波统计可以发现FCS和CS对小鼠视网膜几乎没有影响，表明FCS和CS对小鼠视觉功能表现出微小的影响，长期使用FCS不会引起眼压升高，避免青光眼等副作用发生。TUNEL染色评估不同组的角膜上诱发的坏死效应。结果也显示SDS对角膜组织造成了严重的损害，而FCS组对角膜组织的损害忽略不计。  图5 用于小鼠CNV治疗的FCS/抗VEGFA眼药水  图6 用于治疗兔子CNV的FCS/Eylea眼药水 以CNV为特征的新生血管性AMD（NV-AMD）世界范围内影响极大。VEGF家族成员VEGFA及其受体VEGFR2有助于CNV发生。反复玻璃体内注射抗VEGF是临床上治疗NV-AMD的金标准，但存在患者依从性相当低和严重副作用的问题。FCS/抗VEGFA纳米颗粒通过自我组装制备，用于治疗NV-AMD。通过FFA和OCT观察不同处理2周后CNV小鼠视网膜。经FCS/抗VEGFA眼药水治疗后，小鼠CNV症状明显减轻，达到接近玻璃体内注射抗VEGFA小鼠水平。荧光素钠相对荧光强度和CNV病变的面积和厚度都明显下降。并且光斑条件下A波和B波都明显增加。此外，静脉注射组和FCS/抗VEGF眼药水组在光照条件下的B波也明显增加。 接着将患CNV的兔子随机分为三组：PBS眼药水、FCS/Eylea纳米复合物眼药水、玻璃体内注射Eylea组。相比玻璃体内注射Eylea和渗透性FCS/Eylea眼药水都缓解了紫蓝兔CNV。无论是FCS/Eylea眼药水还是玻璃体内注射Eylea的治疗，第7天和第21天的荧光信号都有所降低。激光凝固后观察到脉络膜和视网膜有明显血管和组织增生，使用FCS/Eylea眼药水或玻璃体内注射治疗1个月后，增生组织面积明显减少。此外，FCS/Eylea眼药水或玻璃体内注射Eylea后，VEGF的表达和新血管的形成也明显减少，上述结果表明，FCS可以成功地将Eylea等治疗性抗体输送到兔眼的后段（脉络膜和视网膜），以抑制血管生成和治疗CNV，达到与Eylea玻璃体内注射相媲美的治疗效果。 总之，本文通过用氟碳链修饰天然CS，开发一种特殊眼屏障穿透性聚合物，用于大分子眼科药物输送，使用眼药水治疗眼底疾病。FCS可以与抗体自组装，形成稳定的纳米复合物，并通过穿透眼部结构屏障有效将其送入视网膜和脉络膜，而不会对治疗动物造成明显的视力下降或其他副作用。FCS可以通过促进肌球蛋白轻链2磷酸化来诱导紧密连接相关蛋白的重新排列，导致角膜和结膜组织上皮细胞之间紧密连接暂时打开，使FCS/蛋白复合物能够在眼内穿透。用FCS/抗PDL1眼药水在脉络膜黑色素瘤小鼠模型和用FCS/抗VEGF抗体眼药水在CNV小鼠和兔子模型中都验证了治疗效果。 本文开发的眼屏障渗透载体FCS会彻底改变目前眼底疾病治疗策略，抗体眼药水治疗方式在病人依从性和副作用风险方面无疑优于玻璃体注射方式。虽然还需进一步严格的临床前研究，但目前试验研究，已经证明基于FCS的治疗性蛋白眼药水方案在未来临床转化中具有广阔的前景，可用于眼病治疗。在未来对患者的使用中，可以加入抗生素红霉素，以防止治疗过程中的潜在感染风险。在大分子眼科药物领域本技术是一个具有巨大市场潜力的平台技术。 文章来源： https://www./doi/10.1126/sciadv.abq3104 了解更多 搜索“EngineeringForLife”公众号了解更多内容~  |
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来自： 新用户88267667 > 《眼睛科》
