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随着精准护肤的趋势以及系统生物学、计算生物学的发展，基于大数据的生物信息学所衍生的网络药理学（Network Pharmacology）在皮肤科学和功效护肤的成分开发和组方设计中的应用逐步成为可能。 网络药理学基于系统生物学的理论，用生物信息学和网络分析方法对生物系统进行分析，从系统水平研究皮肤问题的发生机理以及成分作用机制，同时可以实现多成分、多途径、多靶点协同的效果。 拜合医药基于清华长三角研究院衰老科学创新研发中心（ACRDC）KEPLER 90i计算生物学和生物信息学平台，正在通过网络药理学技术路线进行几种多种天然成分的探究。 本论文研究分享是网络药理学方法在研究皮肤问题发生机制的相关性以及特定成分对皮肤问题解决方案的调节机理方面的典型案例。 玫瑰痤疮与痴呆，尤其是阿尔茨海默病(AD)有显著相关性。然而，连接这两种疾病的共同潜在分子机制尚不清楚。本研究旨在揭示常见的分子调控网络，并确定玫瑰痤疮和AD的潜在治疗药物。在AD和玫瑰痤疮中检测到747种重叠DEGs(o l-DEGs)，这些DEGs富含炎症通路、代谢通路以及凋亡相关通路。利用TF调控网络分析，共鉴定出37个常见的TF和靶基因为中枢基因（hub genes）。它们通过利用DGIdb/ CMap数据库来预测玫瑰痤疮和AD的治疗药物。在113种预测药物中，褪黑素(MLT)与AD/玫瑰痤疮中的RORA和IFN-γ两者均有关联。随后，进行网络药理学分析确定了MLT的19个药理靶标，并证实MLT可以部分地调节炎症和血管信号通路来帮助治疗AD/玫瑰痤疮。最后，我们在体内外验证了MLT对玫瑰痤疮的治疗作用及机制。我们发现，MLT治疗通过减少角质形成细胞介导的炎性细胞因子分泌和抑制HUVEC细胞迁移，显著改善了玫瑰痤疮样的皮肤病变。总之，本研究有助于了解玫瑰痤疮和AD共同病理机制，并确定了MLT是通过调节炎症和血管生成治疗玫瑰痤疮和AD的有效策略。 关键词: 玫瑰痤疮，AD（阿尔茨海默病），MLT，网络药理学，炎症，血管生成 玫瑰痤疮是一种慢性炎症性皮肤病，全球患病率超过5% (1)。临床表现为红斑、毛细血管扩张、丘疹或脓疱，可由辛辣食物和饮料以及身心刺激触发或加重(2)。尽管有报道称免疫和神经血管调节异常在玫瑰痤疮中起关键作用，但玫瑰痤疮的确切发病机制尚不清楚(3)。由于缺乏有效的治疗手段，玫瑰痤疮对绝大多数患者来说仍然是一种不治之症(4)。越来越多的研究表明，玫瑰痤疮是一种与代谢、精神和神经系统疾病有关的系统性疾病的表现，如阿尔茨海默病(AD) (5，6)。Thyssen等人在临床上观察到玫瑰痤疮患者的AD风险增加(6)。阿尔茨海默病(AD)，是一种常见的神经退行性疾病，以认知和记忆能力的进行性恶化为特征，对公众健康的威胁日益严重(7)。研究表明，炎性系统调节异常是AD认知功能损害的重要因素(8)。尽管慢性炎症和血管功能障碍是玫瑰痤疮和AD的共同发病机制(9，10)，但链接AD与玫瑰痤疮的详细分子机制尚不充分。通过分子相互作用网络发现的玫瑰痤疮和AD的共同病理可能有助于玫瑰痤疮治疗和AD预防的药物发现。褪黑素(MLT)是松果体产生的一种神经激素，在昼夜节律、睡眠和神经内分泌活动中具有多种调节作用(11，12)。近年来，MLT被认为具有免疫调节、抗血管生成和抗氧化活性(13，14)。MLT缺乏可增加神经变性、免疫调节紊乱和衰老的风险(15-17)。此前有报告称，AD患者体内的MLT水平较低(18，19)，这可能会导致AD患者脑细胞的氧化损伤(20，21)。除此之外，据报告MLT是治疗AD的有效手段，但MLT有益与AD的机制尚不明确。有趣的是，MLT还广泛应用于治疗皮肤疾病，如特应性皮炎(22)、雄激素性脱发(23)和白癜风(22)。然而，MLT对玫瑰痤疮的潜在治疗作用及其详细的药理学机制仍需进行研究。本研究中，生物信息学分析揭示了AD和玫瑰痤疮的生物学功能、转录因子(TF)调控网络和核心靶点。此外，网络药理学方法确定了MLT的药理学靶点网络，并揭示了MLT可部分通过调节炎性和血管信号通路来帮助治疗AD/玫瑰痤疮的机制。最后，在玫瑰痤疮中验证了MLT的治疗作用和机制。 如图1所示，数据是从GEO数据库下载的(https://www.ncbi.h.gov/geo/):GSE5281(GPL570 platform)中为23个组织(10个患有AD的海马组织和13个对照海马组织)和GSE28146(GPL570 platform)中为30个组织(22个患有AD的海马组织和8个对照海马组织)。GSE65914中的38个玫瑰痤疮组织和20个对照组织也是从GEO下载的。将数据标准化，并使用“limma”和“sva”去除批次效应(图S1A，S2A)。使用阈值为|logFC| >0.5且FDR <0.05的R 'limma '包鉴定疾病组织和对照组织之间的差异表达基因(DEGs)。
使用R 'clusterProfiler '、' enrichplot '和' ggplot2 '软件包进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。使用STRING数据库(https:///)构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，综合评分> 0.7。使用“cytoHubba”计算每个基因的权重并探索PPI网络的中枢基因（hub genes），通过Cytoscape软件3 . 8 . 1(https://cyto cape . org)利用“MCODE”来识别代表性模块。TF-靶点是从TRRUST数据库下载的(https://www./trrust/)。AD和玫瑰痤疮中不同表达的TFs可以调节AD/玫瑰痤疮中的DEGs，被认定为关键TFs。使用不同表达的TF和靶基因，通过Cytoscape软件构建TF-靶网络。为了对AD/玫瑰痤疮的药物列表进行优先排序，使用DGIbd数据库将关键TF和靶基因用于潜在候选药物(24，25)，然后还使用联系图(CMap)数据库验证AD和玫瑰痤疮的候选药物(26)。MLT的潜在药理学靶点可通过可访问的在线工具获得，包括传统中医系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、SwissTargetPrediction和TargetNet (27)。使用UniProt数据库校正和识别候选基因(28)。MLT(CID_4091)的分子结构可从PubChem数据库(https://pubm chem . ncbi . nlm . nih . gov/)下载。MMP9_6ESM的蛋白结构可从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)。maestro软件用于如前所述的分子对接分析。本研究中使用的合成肽LL37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES)购自Sangon Biotech(中国上海)。所有肽均经HPLC纯化(纯度> 95%)，并通过质谱分析进行表征。褪黑素购自美国Sigma公司。人重组TNF-α购自PeproTech(USA)。特定的无病原体雌性BALB/c小鼠(6至7周龄；体重，20–25g)购自SLAC实验动物有限公司(中国上海)。实验前，使所有动物均适应实验条件1周。如前所述构建玫瑰痤疮小鼠模型(29)。8周龄BALB/c小鼠(7 ~ 8周龄，体重20 ~ 25g)随机分为4组(对照组、LL37组、MLT组、LL37 + MLT组)。最后一次注射后的12小时处死小鼠，并收集小鼠背侧病变皮肤。根据皮损面积、红斑和厚度(30)评估玫瑰痤疮小鼠模型的炎症严重程度，将皮肤组织分为3部分分别进行RNA提取、HE染色和免疫荧光染色。如果不立即进行实验，则将组织储存在-80°C下直至使用。所有小鼠均置于23°C±2°C(12h光/暗)无菌条件下饲养。所有实验研究方案遵循动物实验指南，并经中南大学湘雅医院伦理委员会批准(批准号:201611610)。将新鲜小鼠背侧皮肤组织固定在4 %多聚甲醛(PFA)中，包埋在石蜡中，并在6μm处切片。随后，对石蜡切片进行苏木精和曙红(H&E)染色，以便在光学显微镜下观察(Olympus，Japan)，然后对真皮浸润细胞的数量进行平均并进行统计学评估。在培养箱中，在37°C 5% CO2条件下，将人永生化角质形成细胞(HaCaT)培养在完全不含钙的DMEM培养基(Gibco，USA)中，培养基中含有10%胎牛血清(FBS) (Gibco，USA)、1% L-谷氨酰胺(Gibco，USA)和1%青霉素/链霉素(Gibco，USA)。当HaCaT细胞达到70%含量时(如果制备HaCaT细胞用于免疫荧光实验，那么则将对数期HaCaT细胞接种于浓度为1×104/孔的24孔细胞爬片板中)，用不含血清的含钙DMEM培养基代替培养基。HaCaT细胞饥饿12 h后，用褪黑素(1 mM)处理24 h，用8 μM LL37或100 ng/ml TNF-α刺激12 h，然后进行RNA提取或免疫荧光检测。免疫印迹实验在HaCaT细胞达到70%浓度后，用褪黑激素(1 mM)处理它们6小时，然后用TNF-α(100 ng/ml)刺激15 min，然后收集细胞蛋白质(其他条件与上所述相同)。在培养箱(37°C，5% CO2)中，在含有10% FBS (Gibco，USA)和1%青霉素/链霉素(Gibco，USA)的完全RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific，USA)中培养人脐静脉内皮(HUVEC)细胞。趋化和迁移实验的详细研究方法参见以下具体章节。使用TRIzol(Invitrogen Life Technologies，USA)的标准RNA提取方法提取细胞和组织样本中的总RNA。NanoDrop分光光度计测定RNA浓度后，对2μg RNA进行逆转录，使用含有dsDNase的Maxima H Minus First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo Scientifific, K1682, USA)合成cDNA链，并使用配有qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme biotechnology co .，Ltd .，Nanjing，China)的Applied Biosystems 7500机器(Life Technologies，USA)分析基因表达。引物见表S11。将新鲜的小鼠背部皮肤组织包埋在最佳切割温度复合物中，并切割6-8μm的冷冻切片。然后，将冷冻组织或HaCaT细胞固定于4% PFA，15分钟。然后，使用封闭缓冲液(0.2% Triton-X/5%驴血清)对样本进行透化和封闭1 h。接下来，将皮肤切片与不同的抗体一起孵育:大鼠抗小鼠CD4抗体(1:100)、大鼠抗小鼠CD31抗体(1:100)和大鼠抗小鼠F4/80抗体(1:100)，这些抗体购自eBioscience。将HaCaT细胞与兔抗-磷-NF-kB p65抗体(1:200，Cell Signaling,USA)在4℃孵育过夜。抗大鼠Alexa 488(1:200；Invitrogen，USA)和抗兔Alexa 594(1:200；Invitrogen，USA)用作二抗，用于在室温下对样品染色1 h。最后，将所有样品用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5分钟以显像细胞核。荧光图像在荧光显微镜((Zeiss, Germany)下采集。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白质。然后，使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)测定蛋白质浓度。将20微克总蛋白溶解在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转移后，用5%非脂乳封闭膜，然后将PVDF与主要抗体(兔抗p65，1:1000；兔抗-磷酸-p65，1:1000；和兔抗GAPDH，1:5000)在4℃下过夜。经TBST冲洗后，将膜与二级辣根过氧化物酶缀合抗体(1:5000，室温下1小时)一起孵育。最后，使用化学发光HRP底物(Millipore，USA)使免疫反应条带可视化，并使用chemicidoctm XRS+系统(Bio-Rad，CA，USA)成像。以GAPDH表达作为内源性对照。使用transwell chambers(8 mm，Millipore，Billerica，MA，USA)进行HUVEC趋化。在24孔培养板中，用1 mM MLT或等体积的空白基质溶液处理24小时后，将HUVEC细胞以2× 104个细胞的密度用100μl无血清RPMI 1640培养基接种到每一个上腔中。然后，将平板放入培养箱中(37°C，5% CO2)。24 h后用棉签轻轻擦去膜上表面的非迁移细胞。此后，用4%多聚甲醛固定15分钟，用0.1%结晶紫溶液对下层细胞染色30分钟。最后，在光学显微镜下(Olympus，Japan)计数被侵细胞数。将密度为6× 105/ml的人脐静脉内皮细胞悬液接种到6孔板上，每孔接种2 ml。在95%的汇合浓度下，将200μl移液管尖端垂直吸取到培养板，并用PBS冲洗非粘附细胞三次。然后，使用光学显微镜(Olympus，Japan)采集图像，以确定0 h的划痕距离。在37°C的培养箱中，将HUVEC与含有3% FBS的RPMI 1640培养基以及1 mM褪黑素或其赋形剂共同培养24 h后，在相同条件下重新拍摄照片。使用Image-Pro Plus软件测量工具测量治疗前后细胞划痕边界距离，将治疗前距离减去治疗后距离，即为细胞在24h时的迁移距离。所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析，并以平均值±SEM表示。单因素方差分析组间数据，采用LSD法进行成对比较。*，P < 0.05；**，P < 0.01和***，P < 0.001视为有统计学意义。 在对GSE5281和GSE28146进行综合生物信息学分析后，与正常组织相比，在AD组织中共鉴定出5091个DEGs(图S1B)。DEGs的GO分析主要与细胞呼吸、ATP代谢过程和ATP代谢过程有关(图S1C和表S1)。此外，KEGG富集分析显示，这些DEGs与神经退行性多种疾病、紧密连接、病毒感染等的通路显著相关(图S1D和表S2)。接下来，我们构建了PPI网络，并使用“cytoHubba”来探索中枢基因（hub genes）(图S2)。使用“MCODE”从PPI网络中提取出前5个代表性模块，模块基因富集于mRNA剪接、网格蛋白介导的内吞、G2/M转换、转移、Gα(q)信号事件等(表1)。 
对于玫瑰痤疮，与正常组织相比，在玫瑰痤疮组织中鉴定出3016个DEGs(图S3B)。GO富集表明玫瑰痤疮与免疫相关的生物过程有关(图S3C和表S3)。KEGG富集结果显示存在免疫相关通路、PPAR通路、病毒感染、细菌感染、代谢相关通路等(图s3D和表S4)。使用“cytoHubba”探索PPI网络的中枢基因（hub genes）(图S4)，使用“MCODE”从PPI网络中提取前5个具有代表性的模块(图S4)。模块基因富集在Gα(i)信号传导事件、干扰素传导、中性粒细胞脱粒、角化等(表2)。
为了揭示共有的调节网络，在AD和玫瑰痤疮中检测到747种重叠的DEGs (ol-DEGs)(图2A)。GO富集分析显示，ol-DEGs与免疫相关过程和脂质代谢过程相关(图2B)。KEGG富集结果显示，ol- DEGs与细胞因子/趋化因子通路、感染性/炎性疾病及代谢相关通路相关(图2C)。与这些结果一致，使用Metascape数据库丰富了炎症、代谢和凋亡相关通路(图2D)。此外，富集分析显示，ol-DEGs与ET中的炎症、血管和感染相关疾病有关(图2E)。转录因子-靶标分析显示，TRRUST数据库中的许多ol-DEGs受TF调控(图2F)，这表明TF调控网络可能在AD和玫瑰痤疮的进展中发挥重要作用。
图2：阿尔茨海默病(AD)和玫瑰痤疮的共差异表达基因(DEGs)。(A)AD和玫瑰痤疮中ol-DEGs的Venn图。(B)ol-DEGs的GO富集分析。(C)co-DEGs的KEGG分析。(D)使用Metascape进行co-DEGs通路的富集分析。(E)使用METascape对DisGeNET中的ol-DEGs进行疾病富集分析。(F)使用Metascape对TRRUST中的ol-DEGs进行转录因子(TF)富集分析。为了进一步揭示AD和玫瑰痤疮中的TF调节网络，我们分析了AD和玫瑰痤疮中具有不同表达潜在靶点的不同表达的TFs。图3A中确定了24个中枢TFs（hub TFs）。AD和玫瑰痤疮中的TF调控网络如图3B和表S5所示。TFs和靶点中富含炎性、血管发育和凋亡相关的信号通路(图3C)。在图3D中，观察到四种模型富含动脉粥样硬化-、IL-17-、蛋白聚糖-和炎性反应相关的信号通路(图3D和表3)。这些结果表明，炎症和血管相关通路在AD和玫瑰痤疮的发病机制中至关重要。
图3：TF调控网络以及AD和玫瑰痤疮的候选药物。(A)AD和玫瑰痤疮中常见的TFs。(B)AD与玫瑰痤疮中的TF调控网络。(C)使用Metascape数据库富集TF-靶基因。通过聚类ID和基因列表识别着色的富集术语网络。(D)玫瑰痤疮和AD中TF靶点的MCODE组分识别。(Venn图显示AD药物、玫瑰痤疮药物、预测药物间的交叉点。(F)桑基图揭示了疾病、药物和靶点之间的相关性。表3：玫瑰痤疮和AD中TF-靶点的MCODE富集分析接下来，我们分析了治疗AD和玫瑰痤疮的潜在药物。使用DGIbd数据库(https:///)，观察到37个中枢基因（hub genes）中有12个是113个预测药物的靶点(表S6)。我们比较了用于AD的74种药物、用于玫瑰痤疮的44种药物以及用于中枢基因（hub genes）的113种预测药物。三种药物(阿司匹林、沙利度胺和羟氯喹)在AD和玫瑰痤疮中有重叠，其中两种(阿司匹林和沙利度胺)在预测药物中被观察到(图3E)，这证明AD/玫瑰痤疮的候选药物具有较高的可信度。此外，三种预测药物(MLT、奥氮平和西酞普兰)已用于AD治疗。桑基图（Sankey diagram）揭示了疾病、药物和靶点之间的相关性(图3F)。这些结果表明，三种预测药物(MLT、奥氮平和西酞普兰)可能是玫瑰痤疮的有效治疗策略。在这些潜在药物中，MLT与类视黄醇相关的孤儿受体α(RORA)以及IFN-γ均有共同关联。通过CMap数据库，MLT被预测为候选药物(表S7)。所以，MLT被选中进行进一步的功能测定。使用TCMSP、TargetNet和SwissTargetPrediction数据库预测了529个MLT药理学靶点，然后使用UniProt数据库删除了重复基因。128个AD/玫瑰痤疮TF靶点与MLT药理学靶点重叠，确定了MLT抗AD/玫瑰痤疮的19个交叉基因(图4A和表S8)。对19个基因的GO分析表明，MLT可影响炎性反应的调节、胶原代谢过程、氧水平反应、血管相关平滑肌细胞增殖等(图4B和表S9)。此外，51 KEGG通路明显富集(P-adjusted< 0.05)，包括糖尿病并发症、脂代谢和动脉粥样硬化中的AGE -RAGE信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、PPAR信号通路和TNF信号通路(图4B和表S10)。接下来，使用STRING分析了19个交叉靶的PPI网络(图4C)，使用cytoHubba鉴定了8个核心基因靶点，即CCND1、EGFR、ICAM1、MMP2、MMP9、PTGS2、SERPINE1和TNF(图4C)。图4：褪黑激素（MLT）在AD和玫瑰痤疮中的药理靶点。(A) MLT对AD/玫瑰痤疮的19个交叉基因。(B) 19个MLT靶点的GO和KEGG富集度分析。(C) 19个MLT靶点的PPI网络。(D)分子对接显示MLT与其靶点的结合。接下来，进行分子对接以鉴定MLT与八个核心靶点之间的潜在结合。结果表明，MLT可与CCND1、EGFR、ICAM1、MMP9、PTGS2和SERPINE1结合，对接评分分别为-5.86、-7.16、-6.02、-5.95、-6.52和-6.81(图4D)。 为了验证MLT对玫瑰痤疮的治疗作用，用MLT治疗玫瑰痤疮样小鼠4天(29)。我们发现，MLT显著改善了LL37诱导的玫瑰痤疮样表型(图5A)。MLT治疗显著减少了泛红面积、泛红评分、皮肤厚度以及炎性细胞浸润(图5B- F)。此外，MLT抑制了玫瑰痤疮样皮炎中的促炎细胞因子，如IL-6、TNF-α、TLR2、TGF-β1、MMP9和VEGF(图5G)。 图5：MLT对玫瑰痤疮的治疗作用。(A) MLT显著减轻了小鼠的玫瑰痤疮样表型。MLT对玫瑰痤疮样小鼠的病变区域(B)、皮肤厚度(C)和发红度评分(D)的影响。(E)玫瑰痤疮样病变的H&E染色。比例尺:100 μm. (F)在玫瑰痤疮样小鼠中定量了皮肤炎性细胞浸润。(G)小鼠中玫瑰痤疮相关标志物的mRNA表达。所有结果都代表至少三个独立实验。数据用平均值±SEM的单项值表示。*P < 0.05，***P < 0.01，* * * P < 0.01。如前所述，CD4+T细胞和Th1/Th17极化细胞的浸润在玫瑰痤疮的发病机制中是必不可少的(31-33)。本研究中，免疫荧光和qPCR分析显示，MLT显著降低了玫瑰痤疮样皮炎中CD4+T细胞的浸润(图6A，B)，并抑制了Th1相关基因(IFN-γ、CCR5、CXCL9、CXCL10)和Th17相关基因(STAT3和IL-20)的表达(34)(图6C)。图6：MLT抑制玫瑰痤疮样小鼠的免疫细胞浸润。(A)玫瑰痤疮样小鼠中CD4+ T细胞的免疫染色。比例尺:50mm。(B)定量浸润的CD4+ T细胞。(C)qPCR分析检测了Th1和Th17相关基因在玫瑰痤疮皮损中的表达。(D)玫瑰痤疮样小鼠的巨噬细胞免疫染色。比例尺:50 mm. (E)在玫瑰痤疮样小鼠中定量巨噬细胞的浸润。(F) qPCR分析检测了巨噬细胞相关基因的表达。所有结果都代表了至少三个独立实验。数据用平均值±SEM的单个值表示。*P < 0.05，***P < 0.01，* * * P < 0.001。巨噬细胞在玫瑰痤疮中也发挥了重要作用(35)。为了研究MLT是否能抑制玫瑰痤疮样皮炎中的巨噬细胞活性，我们检测了F4/80+细胞的浸润。经MLT治疗玫瑰痤疮样皮炎后，浸润的F4/80+细胞数量显著减少(图6D，E)，巨噬细胞相关基因(MIF、CCL3、CCL22和CCR4)的表达显著降低(图6F)。总之，这些数据表明，MLT抑制了玫瑰痤疮的免疫反应。研究表明，角质形成细胞介导的炎性趋化因子和细胞因子的分泌在玫瑰痤疮的进展中起关键作用(29)。在此，我们探讨了MLT对LL37处理的HaCaT细胞中趋化因子和细胞因子表达的影响。结果显示，1 mM的MLT显著降低了LL37诱导的CCL2、CCL20、MMP9、KLK5、IL-6、IL-8和VEGF-c的表达(图7A)。此外，NF-kB下游基因(IL-1α和IL-1β)的表达受到MLT的显著抑制。为了进一步评估精确的MLT的抗炎机制，我们用TNF-α (100 ng/ml)刺激HaCaT细胞，TNF-α是NF-kB活化的最有效诱导剂之一(36)。我们发现TNF-α会诱导趋化因子和细胞因子的mRNA水平，如CCL2、CCL20、IL-8、KLK5、TGF-β1、TLR2、IL-1α和IL-1β，它们通过MLT治疗被明显消除(图7B)。此外，免疫荧光结果还显示MLT对TNF-α诱导的p65易位(图7C，D)和p65/NF- kB磷酸化(图7E)有抑制作用。总之，这些数据表明，MLT通过调节NF-kB信号传导部分改善了HaCaT介导的炎症。图7：MLT降低了角质形成细胞炎性因子的分泌。qPCR分析揭示了MLT对LL37处理的HaCaT细胞(A)和TNF-α处理的HaCaT细胞(B)中炎性细胞因子表达的影响。(C)免疫荧光分析显示为TNF-α诱导的p65易位。(D)细胞核中p65阳性细胞的百分比。(E)p-p65和p65 HaCaT细胞的免疫印迹。所有结果都代表至少t独立变量实验。数据以平均值±SEM的单项值表示。*P < 0.05，* * * P < 0.01，***P < 0.001。使用了双尾不成对student’s t检验。MLT通过抑制人脐静脉内皮细胞的迁移和趋化来减少血管生成 接下来，我们使用免疫染色法分析了MLT对玫瑰痤疮血管生成的影响。如图8A、B所示，经MLT治疗后，CD31+血管数量明显减少。MLT抑制了LL37诱导的HUVEC趋化(图8C，D)和迁移(图8E，F)。总之，这些数据提供了新的证据，表明MLT可能是玫瑰痤疮血管功能障碍的一种有前景的治疗策略。图8：MLT抑制了玫瑰痤疮中的血管生成。(A)玫瑰痤疮样病变中CD31+细胞的免疫染色。比例尺:50mm。(B)定量CD31+微血管。(C，D)采用transwell法检测人脐静脉内皮细胞的趋化能力。(E，F)采用transwell法检测人脐静脉内皮细胞的迁移能力。所有结果都代表了至少三个独立实验。数据用平均值±SEM的单项值表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。采用Bonferroni事后检验或双尾不成对Student's t检验的单因素方差分析。 玫瑰痤疮是一种慢性面部炎性皮肤病，全球患病率超过5% (1)。由于缺乏有效和安全的治疗，玫瑰痤疮可能发展为系统性疾病的表现，并与代谢、精神和神经系统疾病(包括AD)显著相关(37)。因此，迫切需要一种新的、有效的、安全的玫瑰痤疮治疗策略。本研究揭示了AD/玫瑰痤疮中常见的TF调节网络，并确定了MLT为治疗玫瑰痤疮的候选药物。体内外均验证了MLT的治疗作用和机制，网络药理学分析揭示了治疗AD和玫瑰痤疮的MLT相关分子功能和药理靶点。尽管玫瑰痤疮的确切病因尚不明确，但众所周知，血管和免疫调节异常在玫瑰痤疮发病机制中起关键作用。慢性神经炎症在AD的发病机制中具有重要地位(6)。Egeberg等人观察到玫瑰痤疮患者的患AD风险增加，部分是因为玫瑰痤疮和AD之间的促炎介质重叠(6)。与玫瑰痤疮一致，AD中也观察到了血管功能障碍(9)。在本研究中，在AD和玫瑰痤疮中检测到747种ol-DEGs，这些物质富含免疫和代谢相关通路。此外，富集分析显示，ol-DEGs与DisGeNET中的炎症、血管和感染相关疾病相关。这些结果表明，炎性和血管相关通路在AD和玫瑰痤疮的发病机制中起关键作用。基于ol-DEGs，我们揭示了AD/玫瑰痤疮中的TF调节网络，表明了24种TF(包括PPARG、STAT4、sox9和RORA)在调节AD以及玫瑰痤疮中的主要作用。PPARG (PPARγ)是核受体超家族的一员，主要在脂肪组织中表达并调节脂质代谢(38)。最近，研究描述了PPARγ通过抑制细胞因子和MMPs，调节氧化应激敏感通路和NF-kB通路来调节炎症(38)。此外，PPARγ通过调节线粒体功能在AD发病机制中发挥着重要作用，也被认为是一种基于药理学的治疗的有前景的靶点(39)。STAT4是炎症的重要介质，通过调节IFNγ 而发挥作用(40，41)，与AD及玫瑰痤疮的进程密切相关(32, 42)。据报告，RORA是一种脂敏感核受体，具有多种生物功能，如调节炎症、脂质代谢和血管生成(43-46)。RORA明显上调，据报道在AD中起中枢作用(47)。总之，这些关键的TFs可能通过靶向其在AD和玫瑰痤疮中的靶基因而参与炎症和血管生成的调节。然后，将关键TFs及其靶点提交给DGIdb数据库，用于预测AD和玫瑰痤疮的药物，确定了113种候选药物。在AD和玫瑰痤疮中，在预测药物中观察到三种重叠药物(阿司匹林、沙利度胺和羟氯喹)中的两种(阿司匹林和沙利度胺)，这证明了AD/玫瑰痤疮的候选药物具有较高的可信度。此外，三种预测药物(MLT、奥氮平和西酞普兰)已用于AD治疗。其中，MLT被发现是一种可以针对RORA以及TFN-γ的药物。此外，MLT对AD和玫瑰痤疮的潜在治疗作用同样通过CMap得以证实。这些发现表明，MLT可能是治疗玫瑰痤疮的一种有效策略。MLT是一种神经激素，是日常生物节律的主要调节器(48)，并在多种生理过程中发挥重要作用，如衰老过程(13)、神经保护(49)、免疫调节(50)和抑制血管生成(51)。MLT是安全的，且毒性较低，其显示出对包括AD在内的各种疾病的有益作用(52，53)。Houssain等人表明，MLT可以改善睡眠质量，以减轻AD的神经性病理(54)。我们先前的研究表明，玫瑰痤疮患者的睡眠质量较差，这随后可能会通过调控炎性因子而加重玫瑰痤疮(55)。因此，我们推测MLT可能会通过调节睡眠质量来缓解玫瑰痤疮。MLT通常通过作用于MT(1)和MT(2)受体来协调日常节律和季节性节律(56)。此外，RORα和RORβ，核MLT受体，均参与MLT介导的病理性和生理性心脏肥大的调节(57)。最近，在AD和新型冠状病毒治疗中发现了几种MLT的直接靶点和相互作用蛋白，如DAPK1、钙调素(CALM)1和CALM2 (58，59)。为了进一步揭示MLT治疗AD/玫瑰痤疮的潜在分子机制，我们采用网络药理学方法分析了MLT详细的抗AD/抗玫瑰痤疮机制。TF调控网络中的第19个基因被认为是MLT抗AD和玫瑰痤疮潜在的药理学靶标。GO/KEGG富集结果表明，MLT发挥的抗AD和抗玫瑰痤疮作用是通过调控血管相关信号通路和炎症相关信号通路来介导的，如IL-17、NF-kB和TNF。基于上述结果，我们检测了MLT对玫瑰痤疮的治疗作用。结果表明，MLT在体内显著改善了玫瑰痤疮样表型。MLT治疗通过抑制角质形成细胞介导的细胞因子分泌，部分地降低了CD4+T细胞和巨噬细胞浸润以及Th1/Th17极化。此外，MLT显著的抑制了玫瑰痤疮样小鼠模型中的血管生成，部分是通过抑制人脐静脉内皮细胞的趋化和迁移以及VEGF的表达。据报道NF-kB信号通路是在AD和玫瑰痤疮中被激活并作为治疗靶点发挥作用(60-62)。据报道，MLT在治疗神经炎症和神经变性时会抑制NF-kB信号通路(63)。在本研究中，我们发现MLT可抑制TNF-α诱导的炎性HaCaT细胞中NF-kB通路的激活，在LL37或TNF-α处理的HaCaT细胞中，MLT显著降低了NF-kB下游基因IL-1a和IL- 1β的表达。此外，TNF-α和IL-17A也被认为是AD和玫瑰痤疮中的关键细胞因子(32，64，65)。在此，我们还注意到MLT对玫瑰痤疮样小鼠IL-17A/TNF-α的抑制作用。这些结果表明，MLT通过NF-kB/IL-17通路部分减轻了AD/玫瑰痤疮的炎症。考虑到MLT对IL-17、NF-kB和TNF信号通路的抑制作用，MLT可能是治疗患有自身免疫性疾病患者(包括银屑病和白癜风)的一种潜在候选方式。最后，分子对接分析揭示MLT的直接靶点，包括MMP9、CCND1、EGFR、ICAM1、PTGS2和SERPINE1，均为炎症和血管生成相关基因。据报告，MMP9是玫瑰痤疮和AD中的一种关键炎性因子和治疗靶点。值得注意的是，一些具有MMP抑制剂功能的药物，如多西环素和四环素，被用于玫瑰痤疮治疗(66)，而MMP9抑制剂改善了AD小鼠的特异性神经行为缺陷(67)。CyclinD1 (CCND1)是多种癌症中的主要扩增基因(68)，也有报道其通过抑制内皮细胞增殖参与血管生成(69)。ICAM1是一种细胞间粘附分子，通过促进白细胞粘附和随后的迁移来发挥促炎作用(70)、这增加了内皮和上皮屏障的通透性(71)，并促进了免疫细胞活性(72)。ICAM1在玫瑰痤疮和AD中的表达上调(73，74)。SERPINE1，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，与胃癌的免疫应答有关(75)。PTGS2，也被称为COX-2，在启动炎性反应和血管生成中起关键作用(76，77)。此外，研究证明了MLT靶基因(MMP9、CCND1、EGFR、ICAM1、PTGS2和SERPINE1)和玫瑰痤疮相关关键基因(IL-6、IL-1b、IFNγ、IL-17和TNF-α)之间的潜在关联(78，79)。因此，我们推测MLT通过靶向这些药理学靶点来抑制IL-17、NF-kB和TNF信号通路，随后导致AD和玫瑰痤疮中的炎症和血管生成(图S5)。 本研究中，生物信息学分析揭示了共有的TF调控网络以及治疗AD和玫瑰痤疮的潜在药物。此外，针对AD/玫瑰痤疮的有效药理学靶点和治疗机制在体内外实验中得到了验证。总之，本研究有助于了解玫瑰痤疮和AD的共同病理机制，并确定了MLT是通过调节炎症和血管生成治疗玫瑰痤疮和AD的有效策略。https:///10.3389/fimmu.2021.756550
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