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双硫死亡可谓是继2022年初铜死亡发现以来又一细胞死亡领域的重大发现，下面我们就来看看该研究是如何开展的吧。
（原文链接：https://www./articles/s41556-023-01091-2）  纵观全文就会发现，本文的研究手法和铜死亡发现时的研究思路有异曲同工之妙（我的国自然标书没中，怎么改让专家都说好？）。对比两篇论文就能发现，两者都是从已有程序性死亡方式入手，使用抑制剂进行一一排除后，再基于数据库或已有研究基础找到新型死亡方式的诱导因素，从而命名。机制探索上，也都是通过组学手段进行目标关键分子/通路筛选，最后根据已有的信息整合推测可能机制，进行常规的分子机制验证。
第一步：排除其它程序性死亡和因素，明确死亡诱因并命名 如前所述，提出一种新型死亡方式的第一步是排除其它细胞死亡方式的干扰，以及找到真正影响并诱导该新型死亡产生的因素。由于之前研究发现在葡萄饥饿情况下，SLC7A11高表达细胞死亡死亡更迅速（这个分子是不是很眼熟？铁死亡还记得吗？），因此作者在葡萄糖充足和葡萄糖饥饿条件下，分别在细胞SLC7A11过表达细胞内添加铁死亡、凋亡、坏死性凋亡、自噬抑制剂，发现均无法阻止细胞死亡。然而，细胞死亡却能够被还原性试剂（TCEP）抑制。（图1上）
图1（上） 为了进一步明确这一死亡是否受到其它死亡方式的干扰，作者特地在细胞中分别敲除铁死亡另一关键通路蛋白ACSL4和凋亡关键诱导蛋白BAX/BAK，能够抑制葡萄糖充足条件下的细胞死亡，却依然无法逆转葡萄糖饥饿条件下的死亡。 由于葡萄糖与能量代谢有关，因此作者还关注了ATP在该死亡方式中的作用。然而结果却显示，SLC7A11过表达细胞在葡萄糖饥饿条件下ATP水平显著高于对照组，敲除SLC7A11能回复葡萄糖饥饿下二酰胺诱导的细胞死亡。（图1下） 总之，这些结果表明，这种新型死亡方式与二硫化物应激有关，与ATP水平无关。因此将其命名为“双硫死亡”。
图1（下） 第二步：筛选下游关键通路 细胞内的二硫化物应激对氧化还原敏感的蛋白影响较大，因此接下来就是顺理成章的组学筛选，寻找受到二硫化物应激改变的通路。与普通蛋白组不同的是，文中使用的是二硫蛋白组学，即检测二硫键变化的蛋白质。从结果中可以看到，葡萄糖饥饿且SLC7A11高表达条件下，Actin-细胞骨架和细胞黏附相关通路显著富集，包含大量actin细胞骨架蛋白如FLNA/B、MYH9、TLN1、ACTB等（图2）。（所以后面实验的时候不能用actin作为内参了）
图2 第三步：深入的分子机制探索 1.双硫死亡中细胞骨架蛋白的二硫键 蛋白质形成二硫键后迁移速度会变慢，因此在非还原性WB中，如果蛋白形成二硫键，会在分子量较大位置出现条带。利用这个原理，作者检测了蛋白质组筛选到的actin细胞骨架相关的蛋白FLNA/B、MYH9、TLN1、Drebrin、Actin等。结果显示在葡萄糖饥饿条件下，非还原性胶中野生型细胞蛋白均产生二硫键，而敲除SLC7A11后能回复这一现象。能够调节NADP /NADPH比的2DG同样能够回复该表型，但ROS清除剂（Tempo/Trolox）不能。之后，作者进一步对迁移变缓的actin蛋白进行质谱分析，果然在这些蛋白质上发现多个二硫键位点。
图3 2.双硫死亡中F-actin的收缩 既然之前的实验证明Actin细胞骨架相关的蛋白质确实在葡萄糖饥饿，且SLC7A11高表达的情况下多个位点形成了二硫键，那么这些二硫键变化究竟导致了何种表型，从而最终走向了细胞死亡？为此，作者对F-Actin进行了免疫荧光染色观察，发现在葡萄糖饥饿条件下F-Actin调控的细胞骨架显著收缩且与细胞膜分离；而敲除SLC7A11、同时进行葡萄糖和胱氨酸饥饿处理、添加2DG均能回复收缩表型，但ROS清除剂无效，与之前的结果一致。该表型也与双硫死亡时的细胞表型同步。（图4）
图4 3.Rac-WRC（WAVE调节复合物）调控双硫死亡 为了深入探究葡萄糖饥饿和SLC7A11高表达引起F-Actin收缩的具体机制，作者对葡萄糖充足/饥饿条件下的SLC7A11过表达细胞进行了CRISPR/Cas9筛选。结果显示除了SLC7A11、SLC3A2之外，多个与线粒体氧化磷酸化及WAVE调节复合物相关的sgRNA富集。WAVE调节复合物（WRC）促进actin多聚化和板状伪足形成，与细胞骨架调控密切相关。而WRC中的关键蛋白NCKAP1、WAVE2的体外实验证实其能够调控双硫死亡。Rac是WRC的上游激活因子，体外实验表明Rac1的活化形式促进双硫死亡。（图5） 以上结果均证实，葡萄糖饥饿条件下，SLC7A11高表达细胞中Rac-WRC调控的骨架蛋白变化促进双硫死亡发生。
图5 第四步：证明葡萄糖转运和双硫死亡的关系 既然双硫死亡是在葡萄糖饥饿条件下发生，那么阻断葡萄糖摄取是否与此等价？为此，作者使用葡萄糖转运蛋白（GLUT）抑制剂BAY和KL分别进行处理，并检测不同细胞程序性死亡抑制剂的效果，发现获得的结果与葡萄糖饥饿条件下的相同。同样，Actin相关蛋白的二硫键形成和F-actin收缩均与葡萄糖饥饿时相同。最后的体内实验表明，GLUT抑制剂能有效促进双硫死亡，抑制PDX肿瘤生长，但仅限于SLC7A11高表达肿瘤细胞，对SLC7A11低表达肿瘤无效。
图6  本文的开始来源于观察到的一个现象，即SLC7A11调控的胱氨酸转运能够抑制铁死亡的发生，但却不能阻止葡萄糖缺乏条件下的细胞死亡。为了研究这种特殊的死亡现象，作者利用不同死亡方式的抑制剂进行葡萄糖充足/饥饿条件下的处理，将现象更加细化，即SLC7A11高表达细胞在葡萄糖饥饿条件下，才会经历不同于目前已知细胞死亡方式的死亡过程。 在定义和证明这种新型死亡的过程中，作者联系并推测以胱氨酸为代表的二硫键的作用，以及通过蛋白质组学和CRISPR筛选最终锁定了其中的分子机制。这一过程少不了对目标分子功能和细胞内代谢途径的深入理解，以及对大数据结果的筛选经验。 “双硫死亡”究竟是否会成为下一个研究热点和肿瘤治疗潜在靶点呢？让我们拭目以待！
双硫死亡分子机制示意图 |
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