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联系人： 张永亮(cauzhangyl@cau.edu.cn) 王延鹏(yanpengwang@genetics.ac.cn) 一. 接种时期 我们发现，BSMV-sg的接种时期对可遗传编辑的效率具有关键影响。以Bobwhite作为模式品种, 我们分析了在四种不同生长时期接种BSMV-sg的影响。Bobwhite在整个生长周期中, 其主茎最终只会生长出7片叶。根据Bobwhite的生长周期选择4个不同阶段分别进行接种, 分别为: (1) 3-4叶期 (苗期, 播种后2-3周)；(2) 6-7叶期 (营养生长中后期, 播种后5-6周)；(3) 孕穗期 (播种后6周左右)以及 (4) 抽穗后。
图1.不同时期接种BSMV-sg对小麦生长的影响
图2. 抽穗后接种BSMV-sg-TaPDS可引起麦穗白化但未检测到可遗传编辑 在抽穗之后进行接种，可以观察到发病麦穗出现白化表型，但未能检测到可遗传的编辑。 此外，我们发现，在幼苗期 (2-3叶期) 接种BSMV-sg时，携带的sgRNA更容易发生部分或者完全丢失，这可能是由于在进入生殖细胞之前，BSMV-sg需要在发病小麦中侵染更长的时间，外源片段在病毒载体长期侵染植株过程中易发生丢失，这是病毒载体常见的现象。
图3. 在幼苗期接种BSMV-sg时检测到外源片段发生丢失 （A）从小麦幼苗期接种BSMV-sg大约三个月后，提取发病叶片RNA进行RT-PCR检测。Control-1和Control-2分别是野生型的BSMV RNAγ和携带完整sgRNA的RNAγ的质粒对照。(B-C)将RT-PCR扩增出来的片段进行测序，发现部分BSMV-sg载体中的sgRNA片段发生了部分丢失。(D) sgRNA片段发生丢失的BSMV-sg载体与完整BSMV-sg载体的序列比对。该样品中，sgRNA的骨架部分丢失了大约29个碱基。 综合上述发现，在我们的文章中，我们推荐在小麦营养生长的中后期进行接种 (Li et al.,2021, “BSMV infection of wheat”部分)。由于不同小麦品种的生长周期差异较大，且会受到营养条件、光照条件等环境因素的影响，因此实际操作过程中，可以适当灵活调整，但应该控制在孕穗之前完成接种。这与通常利用BSMV作为VIGS载体时的接种时期 (二叶期) 有所不同 (Yuanet al., 2011)。 二. Cas9过表达小麦中Cas9的表达量 我们测试了三种不同的小麦品种，Bobwhite，郑麦7698 (中国农科院作物科学研究所夏兰琴研究员馈赠) 和Fielder，其中Fielder的可遗传编辑效率显著低于另外两种。Western blot结果显示，创制的Cas9过表达Fielder材料中，Cas9蛋白的表达量显著低于另外两种材料。因此，Cas9过表达小麦中，Cas9的表达量也是一个影响BSMV-sg可遗传编辑效率的重要的因素。如果需要使用新创制的Cas9过表达小麦材料，建议先通过Western blot对Cas9蛋白的表达量进行鉴定，较高的Cas9表达，将有助于提高编辑效率，Cas9本身表达水平不高，也会造成编辑效率较低。 三. 靶点的选择 我们注意到，靶点的选择对编辑效率的影响较大，这也是CRISPR在动植物基因编辑中普遍存在的现象。选择新的靶点时，建议先利用原生质体系统对靶点的编辑效率进行测试和筛选，或者构建到BSMV-sg系统中之后，对接种并发病的小麦植株的系统发病叶进行编辑效率的检测，选择高效的靶点是后续获得高效可遗传基因编辑的关键因素之一。 四. 关于FT RNA和tRNA 我们发现，在BSMV-sg中sgRNA的3`端添加一段小麦的TaFT序列，在接种当代，对编辑效率有一定的提高，当以TaPDS作为靶基因时，编辑效率的提高还直接导致了更为明显的白化表型；但是添加tRNA无论是对于接种当代的编辑效率还是对于可遗传的编辑效率，都未观察到效率的提升，实际上，还出现了下降。
图4.文章中使用的TaFT序列与AtFT序列 (Ellisonet al., 2020)的对比 在这项工作开展的过程中，我们在BSMV-sg载体中测试了TaFT，AtFT，三种不同的tRNA (tRNAGly, tRNAMet和tRNAIleu)，但是这些元件的加入都未能进一步提高BSMV-sg的可遗传编辑效率。此外，我们在本生烟中测试了这些载体，也未能检测到发生可遗传编辑的本生烟子代幼苗。多次生物学重复的结果都类似。 实际上，在BSMV基因组RNA的3`端，自身已经存在一个类tRNA结构(Kozlov Yu et al., 1984)，额外的高级结构的加入，有可能对BSMV基因组RNA的原始结构造成干扰，进而影响病毒的侵染活力。 近期，Wu等人 (2022) 发现，FT在三叶橙 (trifoliate orange) 中以蛋白的形式转运 (Wu et al., 2022)，提示FT的转运形式可能在不同物种中不完全一致。 五. 编辑效率的检测方法 在BSMV-sg的接种当代，不同的侵染部位，发病的效率、基因编辑的效率以及基因编辑的类型可能会有所不同。因此，在对某一株发病小麦采样时，建议从三个不同的部位采集样品，混合提取DNA后进行检测。在对编辑效率和编辑类型进行分析时，建议采用二代测序进行分析，可以更准确分析出靶点的编辑效率和突变的类型。利用BSMV-sg获得的子代 (M1代) 突变体中，有一部分是可以遗传的嵌合突变体，需要继续传代至M2代获得纯合突变体。此外，在检测到M1代突变体之后，也可以对这些突变体叶片提取RNA，使用病毒载体引物进行RT-PCR鉴定BSMV的种传情况。 六. 接种方法 实现编辑的前提是BSMV-sg成功侵染小麦，因此，需要确保接种后的小麦已经发病，正常情况下，发病的小麦，叶片会出现明显的褪绿条纹。BSMV-sg的接种，我们采用的是本生烟发病叶片研磨后的汁液转接的方法 (Yuanet al., 2011)，即首先通过农杆菌浸润本生烟叶片，5-7天后，采集注射叶片，研磨后，取研磨液摩擦接种Cas9过表达的小麦叶片，建议接种最新展开的两片叶片。通常情况下，转接后7天，可以观察到系统发病症状。这种接种方法在Bobwhite和Fielder中的发病效率通常可以超过80%，但在一些抗性较强的品种 (例如科农199和郑麦7698) 中，发病效率会有所降低。接种效率和编辑效率随着小麦品种的不同会存在差异。 小麦是世界上最为重要的农作物之一，我们希望BSMV-sg载体的开发为小麦的基础研究和遗传改良提供一种简单高效的新途径。目前我们开发的BSMV-sg载体已经被北京大学、华中农业大学、西北农林科技大学和中国农业大学植保学院等单位成功用来编辑小麦中感兴趣的靶基因，且获得了较高的编辑效率。欢迎更多有需要的同事使用这个系统，并提供建议和意见，也欢迎各位同行来实验室交流和探讨。 附件1：BSMV-sg接种小麦操作流程 附件2：BSMV-sg基因编辑载体的构建及使用说明 附件3：pCB301-BSMVγ-SmR载体部分序列 附件下载链接： https://pan.baidu.com/s/1qguc42ixtH0Ycc7H-uXKew 参考文献: 1. Chen,H., Su, Z., Tian, B., Liu, Y., Pang, Y., Kavetskyi, V., Trick, H.N., and Bai,G. (2022). Development and optimization of a Barley stripe mosaic virus(BSMV)-mediated gene editing system to improve Fusarium head blight (FHB)resistance in wheat. Plant Biotechnol. J. https:///10.1111/pbi.13819 2. Ellison,E.E., Nagalakshmi, U., Gamo, M.E., Huang, P.J., Dinesh-Kumar, S., and Voytas,D.F. (2020). Multiplexed heritable gene editing using RNA viruses and mobilesingle guide RNAs. Nat. Plants 6,620-624. 3. KozlovYu, V., Rupasov, V.V., Adyshev, D.M., Belgelarskaya, S.N., Agranovsky, A.A.,Mankin, A.S., Morozov, S., Dolja, V.V., and Atabekov, J.G. (1984). Nucleotidesequence of the 3'-terminal tRNA-like structure in barley stripe mosaic virusgenome. Nucleic Acids Res. 12,4001-4009. 4. Li,T., Hu, J., Sun, Y., Li, B., Zhang, D., Li, W., Liu, J., Li, D., Gao, C.,Zhang, Y., et al. (2021). Highlyefficient heritable genome editing in wheat using an RNA virus and bypassingtissue culture. Mol. Plant 14,1787-1798. 5. Yan-Mei Wu,Yu-Jiao Ma, Min Wang, Huan Zhou, Zhi-Meng Gan, Ren-Fang Zeng, Li-Xia Ye,Jing-Jing Zhou, Jin-Zhi Zhang, Chun-Gen Hu, Mobility of FLOWERING LOCUS Tprotein as a systemic signal in trifoliate orange and its low accumulation ingrafted juvenile scions, Hortic. Res., 2022; uhac056, https:///10.1093/hr/uhac056 6. Yuan,C., Li, C., Yan, L., Jackson, A.O., Liu, Z., Han, C., Yu, J., and Li, D.(2011). A high throughput Barley stripemosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots anddicots. PLoS One 6, e26468. 小麦族多组学网站：http://wheatomics. |
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