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核酸治疗是一种具有很大潜力的治疗方式，其通过引入一段核酸序列上调、下调或者更正目的基因，进而对疾病进行更精确的治疗。核酸药物按药物的组成形式，可以分为 DNA 药物及 RNA 药物两大类，其中 RNA 药物又可以分为 ASO、激活小核酸（saRNA）、siRNA、miRNA、mRNA 及核酸适配体（Aptamer）。 siRNA 是一类人工合成的双链 RNA--由正义链及反义链组成，其长度通常为 21nt，反义链通过与 mRNA 完全互补配对，进而降解 mRNA 发挥其转录后调控功能。siRNA 在细胞中降解 mRNA 的机制与 miRNA 类似，如 Fig.1 所示，合成的 siRNA 通过胞吞作用进入细胞中，随后少量的 siRNA 能够发生溶酶体逃逸进入细胞质，进入细胞质后 siRNA 与 Dicer 及 TRBP 形成 RLC 复合物，RLC 复合物招募 AGO2，随后正义链被降解，siRNA 反义链与完全互补配对的 mRNA 序列结合，接着 AGO2 对mRNA 进行切割，最终引起 mRNA 的降解。  Fig. 1 siRNA 及 miRNA 的作用机理 siRNA 药物成药优化方案 纵观 RNAi 治疗的发展史，从 1998 年第一次在线虫中观察到 RNAi 现象，到2006 年 RNAi 研究获得诺贝尔奖，再到 2017 年第一款 siRNA 药物获批上市，历经了 20 多年的旅途，siRNA 才最终实现了成药。 siRNA 经历了这么久的时间最终成药，主要克服的问题有以下 6 方面： 1. 靶序列的特异性 2. siRNA 的脱靶作用 3. siRNA 的免疫原性 4. siRNA 系统给药后，非靶器官目的基因降解引起的毒副作用 5. siRNA 进入细胞的效率 6. siRNA 的溶酶体逃逸 针对以上的问题与挑战，目前可以通过 3 方面进行解决与改善：1.序列的优化及选择 2.化学修饰 3. 递送系统。 1. 序列的优化及选择 siRNA 的序列选择主要是为了达成两方面的效果： 其一是减少其脱靶可能性。其二是针对靶蛋白具有很好的敲低效果，同时其具有较小的 EC50。 SiRNA 脱靶有三种方式，第一种为 siRNA 反义链的 miRNA like 脱靶效应，即 siRNA 发生了类似 miRNA 的作用形式，通过种子序列与 mRNA 序列特异性结合，进而导致 mRNA 降解或者翻译受阻。 第二种为 siRNA 的反义链由于错配引起脱靶效应，siRNA 与 mRNA 发生结合时，是允许发生一定的错配的，进而引起错配的 mRNA 序列降解。 而脱靶的第三种方式为原本需要进行降解的正义链进入了 RISC 复合物，引起非目标基因的敲低。 因此设计 siRNA 时，首先需要对 siRNA 的序列进行评估，作为 siRNA 的龙头公司，Alnylam 具有完善的 siRNA 序列设计及评分方案，首先，Alnylam 会选择目的基因的转录本，针对转录本通过步移法设计所有可能的 19nt 的 siRNA 序列，序列需满足的条件为不含有 7 个以上的重复核苷酸。随后对所有满足条件的 siRNA 进行脱靶预测。脱靶预测主要分为 2 个方面：1.Mismatch score 2. miSeedScore。通过对这两方面的得分进行加权计算，进而对设计的 siRNA 序列进行排序，淘汰评分较高的 siRNA 序列，具体的评分规则如图 Table. 1 所示。而针对正义链所引起的脱靶效应一般可以通过化学修饰的方法，及对序列的优化选择，通过改变其热力学稳定性，提高正义链被降解的效率进而规避其引起的脱靶效应。  Table. 1 Alnylam 公司脱靶评分 siRNA 的基因敲低能力及其 EC50 需要通过实验来确认，但是在实验前，通过前期 siRNA 敲低实验的经验总结，Alnylam 归纳出几条可能具有较好基因敲除能力的 siRNA 的通用特征：1.在 5’ 第一个位置通常部位 GC 碱基。2.在 5’ 的第13 及 14 位通常不为 G。3.在种子序列部分有 3 个及以上的 U 和 A 碱基。可以通过这些特征对设计的siRNA 有效性进行预测，删去一些不符合特征的 siRNA 序列。通过脱靶筛选及有效性预测的 siRNA，在体外进行单剂量或者双剂量的靶基因敲低实验，根据这次敲低实验，筛去基因敲低效果较差的 siRNA 序列。随后，对经过初筛的 siRNA 序列进行 EC50 实验，根据 EC50 结果选择基因敲低效果好，同时起效量低的 siRNA 作为 candidates 进行后续的体内外功能实验。 2.化学修饰 提升 siRNA 成药性的第二点为化学修饰，化学修饰例如 GNA、LNA、2’-MOE 等能够有效的改善 siRNA 的免疫源性，降低 siRNA 的脱靶毒性，同时增加 siRNA 的有效性。化学修饰根据其位点的不同，可以分为 3 种不同修饰类型：1.磷酸修饰 2.核糖修饰 3.碱基修饰。通常这 3 种修饰方案会同时出现在siRNA 中。 Alnylam 的修饰方案的演变主要经历了以下几个过程，如Fig. 2 所示。首先是 STC 修饰方案，STC 修饰方案采用的修饰 1.核糖修饰，包括 2’-deoxy-2’-fluoro (2’-F)和 2’-OMe 2.磷酸修饰，采用了 PS（硫代磷酸）修饰。STC 修饰为一种通用性修饰方案，能够增加 siRNA 稳定性及对 mRNA 的亲和性，但是在随后的临床试验中，使用该修饰方案的 siRNA 药物的病人出现了死亡，尽管后续的研究表明死亡并非药物本身引起，但是该修饰方案的 siRNA 药物还是引起了安全性担忧。随后 Alnylam 下一代 siRNA 修饰方案 ESC 出现。ESC 修饰比 STC 修饰多了 4 个 PS 修饰，同时另一个较大的改变为减少了 2’-F 修饰的核苷酸数，减少 2’-F 主要是由于过多的使用 2’-F 修饰可能会导致增加 siRNA 的毒性。ESC 与 STC 修饰方案相比大大提高了 siRNA的有效性及半衰，ESC 修饰方案使 siRNA 药物具有更优的 PK 及 PD，同时减低了siRNA 药物的使用剂量，Alnylam 用于治疗急性肝卟啉症的 GIVLAARI 使用的即为ESC 修饰方案。随后 Alnylam 对 ESC 修饰方案进行了优化，设计出了 advanced ESC 修饰方案，advanced ESC 进一步减少了 2’-F 修饰，并且优化了 2’-F 及 2’-OMe 的配比及修饰位点。Advanced ESC 修饰在不影响 siRNA 有效性的基础上进一步提高了 siRNA 的稳定性。随后 Alnylan 进一步开发出了 ESC 修饰方案，该方案在 ESC 修饰的基础上在 siRNA 反义链中种子序列部分添加了 GNA 修饰，该种修饰主要解决的问题为 siRNA 的 miRNA like 的脱靶效应及肝毒性问题。目前多种 siRNA 药物使用 ESC 修饰方案，例如 ALN-AATP2, ALN-HBV02, ALN-AGT 等。  Fig. 2 Alnylam siRNA 修饰方案 除了 Alnylam 外，Arrowhead Pharmaceuticals, Silence, Dicerna 等也都开发出了相应的化学修饰方案，用于改善 siRNA 的成药性。 3. 递送系统 提升 siRNA 成药性的第 3 点为递送系统，目前应用于 siRNA 药物的递送系统有脂质体，GalNAc，exosome，多肽，共轭聚合物等，其中 LNP 及 GalNAc 已在临床上被批准使用。 A. LNP LNP 主要有 4 种物质组成：阳离子脂质，胆固醇，辅助性脂质，PEG-脂质。其中各家公司使用的 LNP 的区别主要在于阳离子脂质及 PEG-脂质上，阳离子聚合物为 LNP 的核心组分，不同的公司都具有其特有的阳离子聚合物，图 Fig. 3 所示的为已被 FDA 批准的 RNA 药物使用的 LNP 的组分。  Fig. 3 已获批的 LNP 脂质化学结构 LNP 能够有效的保护 siRNA，使 siRNA 免受核酸酶的降解和肾脏的清除，并且能够有效的转移 siRNA 进入靶器官及靶细胞。包装了 siRNA 的 LNP 在循环过程中几乎不带电，并且其中的 PEG-脂质（PEG2000-C-DMG）在循环过程中会逐渐丢失，被血清蛋白，尤其是载脂蛋白 E（ApoE）取代，而 ApoE 蛋白的功能为转运脂质进入肝脏，因而 LNP 被肝细胞所吸收，LNP 被吸收后进入到内涵体中。内涵体 pH 为酸性，在酸性环境中，脂质再离子化，从而导致 LNP 分解。解体的LNP（借助 DLin-MC3-DMA 展开的脂质尾部构型帮助）与内涵体膜之间发生静电和疏水相互作用，从而帮助 siRNA 逃逸到细胞质中。与使用较早的可离子化脂质（DLin-DMA）ALN-TTR01 相比，Patisiran 在体内的效力提高了 10 倍以上。 Alnylam 的 Patisiran 的成功上市说明了 LNP 作为药物载体的可行性。然而可电离阳离子的毒性限制了其最大的给药剂量，并且使用其长期给药引起的副作用仍需要进一步观察。研发更安全的脂质是 LNP 后续临床应用中发展方向。 B. GlaNAc GalNAc 是唾液糖蛋白受体(ASGPR)的配体，ASGPR 是一种在肝细胞中特异性高表达的一种内吞受体（~500,000 拷贝/细胞），但是其在别的细胞中几乎不表达。ASGPR 和网格蛋白介导的内吞作用可以有效地运输半乳糖衍生的配体从细胞表面到细胞质。在此过程中，ASGPR 的循环周期大约为 15 分钟，因此 ASGPR 是一种理想的肝靶向受体。通过将 siRNA 共价结合的方式连接于三价或四价 GalNAc，能够实现 siRNA 高效的肝脏递送。 不同的公司使用的 GalNAc 与 siRNA 的连接方式有所不同，例如 Alnylam 将 GalNAc 连于 siRNA 正义链的 3’端，而 Arrowhead 则连于正义链的 5’端。而 Dicerna 则采用了 GalNAc 四聚体，基于其特殊的 DsiRNA 结构。除了能够特异高效靶向肝细胞外，GalNAc-siRNA 进入细胞的方式被 ASGPR 调节，这是一种天然存在的机制，因此相对使用脂质体进行递送而言具有更高的安全性。因此，国内外多家 siRNA 公司对 GalNAc 的递送方式具有管线布局，例如 Alnylam, Arrowhead, Dicerna, 瑞博等。目前许多 GalNAc-siRNA 药物已进入临床研究（Table. 2），而如何突破肝靶向，找到别的组织靶向的“GalNAc”随着 siRNA 药物的发展成为了破局的关键所在。    Table. 2 目前已上临床的 GalNAc-siRNA 药物 C. LODER LODER 基质是一种高分子量的聚乳酸共乙醇酸（PLGA）共聚物，其是直径为1nm，高度为 5nm 左右的圆柱体，如图 Fig. 4 所示。其为 Silenseed 公司研发的一款 siRNA 递送系统，其能够通过移植肿瘤的方式，使 siRNA 药物直接到达肿瘤细胞，并且 LODER 还具有缓释能力，在保护 siRNA 免受环境中的核酸酶降解的同时能够使 siRNA 在肿瘤中缓慢释放达 2 月。  Fig. 4 LODER 递送示意图 目前 Silenseed 公司使用LODER 递送系统在研有多款药物（Fig. 5），其中siG12D-LODER 已进入临床 II 期，针对的适应症为 G12D KRAS 突变的胰腺癌。  Fig. 5 Silenseed 管线 D.Exosome 近年来，外泌体（exosome）作为一种重要的细胞间交流的工具得到了越来越多的关注。大多数细胞都能够释放许多小囊泡（EV），这些小囊泡装载了许多的物质如蛋白质、脂质体和各种类型的核酸。根据这些小囊泡的形成过程，细胞外囊泡可以宽泛地分为凋亡小体、细胞微泡（MV）和外泌体（exosome）。Exosome 的形成依赖于细胞本身的生理学和病理学环境，因此健康的个体与不同种类的病人分泌的进入循环系统的 exosome 中所携带的 RNA（miRNA、mRNA、lncRNA） 和蛋白是不同的，这使得其能够成为潜在的诊断疾病的生物标志物。肿瘤来源的exosome 中含有大量的 miRNA，并且不同的肿瘤分泌的miRNA 的种类是不同的，所以循环系统中 miRNA 的种类和含量是一种重要的肿瘤标记物。exosome 同样也是许多非肿瘤类疾病的生物标志物，如心血管疾病、肾病、神经退行性疾病等。 除了作为疾病的生物标志物外，exosomes 作为一种内源性的细胞外囊泡，其直径大小与纳米级载体相似。并且 exosome 能够携带不同的信号分子（RNA 和蛋白），因此其具有潜在的作为药物递送载体的能力。并且相对于外源性的纳米载体，exosome 具有不引起免疫反应并且不具有生物学毒性等优势。 目前 M.D. Anderson Cancer Center 发起的临床 I 期研究，探索 Exosome 作为递送载体，运送针对 KRAS G12D 突变的 siRNA 对胰腺癌的治疗作用。Exosome 的来源为间充质干细胞，根据其临床前研究表明，间充质干细胞来源的 exosome 中富含CD47 蛋白，同时研究表明 CD47 蛋白能够延长 exosome 的半衰期，减慢其被单核细胞清除的速率，同时动物实验结果表明，使用间充质干细胞来源的exosome 装载 siRNA 治疗胰腺癌有很好的疗效。如若 I 期临床研究能够得到较好的临床效果，则为 exosome 的应用打开了另一扇大门。 E.AOC 抗体药物偶联物（ADC）是通过一个化学链将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。目前通过 ADC 药物也延伸出了将 siRNA 连接于抗体上的抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）药物。AOC 药物利用了抗体分子特异性高，成药性好，生产方便等特征，实现了 siRNA 肝外靶向及多样化组织递送的能力。目前，研发 AOC 药物的公司有Avidity Biosciences， Dyne Therapeutics，启德医药科技有限公司等，目前 AOC 产品的最快的为 Avidity Biosciences 的 AOC 1001，针对的适应症为强直性肌营养不良 1 型患者（DM1）， 目前已进入 1/2 期临床研究，Avidity Biosciences 公司的管线布局如 Fig. 6 所示。  Fig. 6 Avidity Biosciences 公司的管线布局 F. PNP PNP 是由人工设计和合成的赖组氨酸多肽共聚物，目前圣诺制药使用的siRNA 递送系统即为其自主研发的 PNP 药物递送系统。PNP 递送系统的优势在于每个 PNP 纳米颗粒能够携带多种 siRNA 分子，进行多靶点的联合给药，例如圣诺目前跑得最快的产品 STP750，为 TGF-β1 和 COX-2 的双靶点 siRNA 药物，其适应症为原位鳞状细胞癌，目前已进入 II 期临床研究。同时，PNP 第二个优势为其组成成分为天然氨基酸，因此毒副作用小。目前圣诺使用 PNP 作为递送载体的管线遍布肿瘤，纤维化，医学美容等各个方面。 siRNA 药物公司及管线布局 目前已上临床的 siRNA 药物共有 43 种，如 Table. 3 所示，目前已上临床的siRNA 药物主要针对的疾病类型为罕见病，代谢类疾病，眼科疾病及感染类疾病， 针对肿瘤及肝外靶向的 siRNA 药物较少。SiRNA 药物针对的靶器官主要为肝脏及眼部疾病，主要是由于目前递送系统实验肝外靶向仍然是一个挑战。目前学术界及各公司也在积极探索肝外组织的递送系统，如针对 LNP 筛选使用的 DNA 条形码技术，能够高通量的筛选各组织靶向的 LNP 成分，另外如适配体偶练修饰的纳米颗粒，也能够使纳米颗粒具有一定的组织靶向性。随着递送系统的不断成熟及优化，siRNA 药物的应用也必将迎来更广阔的天地。
Table. 3 目前已上临床的 siRNA 药物总结 参考资料 1.Suzuki Y, Ishihara H. Difference in the lipid nanoparticle technology employed in three approved siRNA (Patisiran) and mRNA (COVID-19 vaccine) drugs. Drug metabolism and pharmacokinetics. 2021;41:100424. 2. Kamerkar S, LeBleu VS, Sugimoto H, Yang S, RuivoCF, Melo SA, et al. Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer.Nature. 2017;546(7659):498-503. 3. Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and futuredirections of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(6):421-46. 4. Hu B, Zhong L, Weng Y, Peng L, Huang Y, ZhaoY, et al. Therapeutic siRNA: state of the art. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):101. |
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